快速高效检测植物体内蛋白泛素化修饰研究方法

论文摘要

UPS参与植物中绝大多数的信号转导通路。其中,一些激素的受体本身就是E3泛素连接酶,如茉莉酸（JA）受体COI1和生长素（auxin）受体TIR1都是F-box蛋白,它们通过特异性介导相应转录抑制子的泛素化降解来传递激素信号,但对于整个UPS体系而言,由于技术的限制,迄今为止仅见少量泛素连接酶与特异性底物间生化机制的报道。用大肠杆菌（Escherichiacoli）表达蛋白实施泛素连接酶泛素化修饰底物的体外实验是验证泛素连接酶/底物对的常用方法,但由于体外实验缺乏某些蛋白必需的转录后修饰,导致实验结果有时存在假阴性。利用农杆菌注射烟草（Nicotianabenthamiana）瞬时表达蛋白的方法,建立高效的植物体内检测蛋白泛素化系统,可以快速检测蛋白泛素化,包括检测泛素连接酶和底物的特异性相互作用、底物蛋白的自身泛素化、泛素连接酶对底物降解的促进作用、26S蛋白酶体抑制剂MG132对底物降解的抑制作用以及用植物内源表达蛋白进行体外泛素化反应。

论文目录

• 1 实验材料
•   1.1 烟草
•   1.2 菌株
•   1.3 载体
• 2 试剂
• 3 试剂配方
• 4 设备与软件
• 5 实验程序
•   5.1 检测泛素连接酶和底物蛋白间的相互作用
•     5.1.1 实验流程
•     5.1.2 实例说明
•   5.2 检测体内表达预期底物蛋白的泛素化修饰
•     5.2.1 实验流程
•     5.2.2 实例说明
•   5.3 检测26S蛋白酶体抑制剂MG132对预期底物蛋白降解的抑制作用
•     5.3.1 实验流程
•     5.3.2 实例说明
•   5.4 体内实验检测泛素连接酶对底物降解的促进作用
•     5.4.1 实验流程
•     5.4.2 实例说明
•   5.5 半体内的蛋白降解反应
•     5.5.1 实验流程
•     5.5.2 实例说明
•   5.6 检测26S蛋白酶体抑制剂MG132对泛素连接酶促进底物蛋白降解的抑制作用
•     5.6.1 实验流程
•     5.6.2 实例说明
•   5.7 用烟草注射表达的蛋白质进行体外泛素化反应
•     5.7.1实验流程
•     5.7.2 实例说明
• 6 注意事项

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 刘利静,赵庆臻,谢旗,于菲菲

关键词: 体内泛素化检测,泛素连接酶,烟草瞬时表达系统

来源: 植物学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东大学生命科学学院,聊城大学生命科学学院,中国科学院遗传与发育生物学研究所,中国科学院大学

基金: 山东大学齐鲁青年学科建设经费(No.11200087963080)

分类号: Q943.2

页码: 753-763

总页数: 11

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