重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho构建的实验研究

论文摘要

目的本研究旨在构建并制备增强型荧光蛋白（EGFP）基因和Klotho基因重组腺病毒载体AdEGFP-Klotho,并将其感染HEK293细胞,为基因治疗提供研究基础。方法设计含有NheⅠ与NotⅠ双酶切位点的引物,应用PCR方法扩增Klotho基因,将其连接到EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-Klotho,利用Polyfectin脂质体将骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293细胞进行同源重组,得到重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho,并包装扩增,测定病毒颗粒数及滴度。采用PCR方法对重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho进行鉴定,并进行Klotho基因测序。结果经PCR和NheⅠ、NotⅠ双酶切鉴定,重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho中证实含有Klotho基因,测序结果和设计序列比对一致,重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho构建成功。滴度为2.0×1010 Tu/mL,成功感染HEK293细胞,感染复数（MOI）=100,感染效率达91.75%,从Ad-EGFP-Klotho重组腺病毒载体中可以检测到3 045bp的条带,表明目的基因已成功整合在重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho基因组中。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了含有EGFP和Klotho基因的重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho,制备获得高滴度的病毒,可高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 质粒、菌株与细胞
•     1.1.2 实验试剂
•   1.2 方法
•     1.2.1 引物设计
•     1.2.2 重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-Klotho的构建及鉴定
•     1.2.3 重组腺病毒载体Ad-EGFP-Klotho的包装
•     1.2.4 重组腺病毒质粒Ad-EGFP-Klotho的扩增及纯化
•     1.2.5 重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho转染HEK293细胞情况
•     1.2.6 重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho的病毒滴度测定
• 2 结果
•   2.1 重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-Klotho的鉴定
•   2.2 重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho的鉴定
•   2.3 重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho感染HEK293细胞的效率
•   2.4 重组腺病毒Ad-EGFP-Klotho的滴度测定
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 贾政,刘茜,邢正江,邹弘麟,李亚雄,魏玲,韦杰,李春城,孟凡棣

关键词: 基因,绿色荧光蛋白质类,腺病毒,杂合子

来源: 重庆医学 2019年23期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,基础医学

单位: 昆明医科大学附属延安医院心脏大血管外科/云南省心血管外科研究所,昆明医科大学附属延安医院老年医学科,中国人民解放军联勤保障部队第920医院干部病房

基金: 云南省基础研究计划（昆医联合专项）（2018FE001-276）,云南省昆明市卫生科技人才培养千工程科研项目[2018SW（后备）06],昆明医科大学附属延安医院院内项目（yyky016-020）

分类号: R346;Q78

页码: 3970-3973

总页数: 4

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