为建立一种快速、灵敏的检测根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法,以根串珠霉菌核糖体大亚基RNA基因的部分基因序列为靶基因,用在线引物设计软件Primer Explorer V5.0设计并合成4条特异性引物F3、B3、FIP和BIP进行LAMP扩增试验,分别设置Mg2+终浓度为2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L,d NPTs终浓度为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L,内引物FIB/BIF终浓度为0.25mmol/L、0.5mmol/L、0.75mmol/L、1mmol/L、1.25mmol/L、1.5mmol/L,甜菜碱终浓度为0、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L,Bst DNA聚合酶终浓度为0.08U/μL、0.16U/μL、0.24U/μL、0.32U/μL、0.40U/μL、0.48U/μL,反应温度为50℃、53℃、56℃、59℃、62℃、65℃、68℃、71℃,反应时间为10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min。扩增产物用SYBR Green I和琼脂糖凝胶电泳检测LAMP反应的结果。以烟草茎点霉（Phoma tabaci Em.Sousa da Camara）、烟草拟盘多毛孢（pestalotiopsis nicotiae）、烟草白星病菌（phyllosticta nicotianae Ell.etev）、烟草碎叶病菌（Mycosphaerella nicotiana）、烟草赤星病菌（Alteraria alternata （Fries） Keissler）、腐霉（Pythium）、根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）、柑橘青霉（P.italicum Wehmer）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、烟草炭疽病菌（Colletotrichum micotianae Averna）和烟草灰霉病菌（Botrytiscinerea Per.etFries）基因组DNA为模板进行特异性验证。通过将根串珠霉菌基因组DNA稀释10倍梯度,分别获得DNA浓度1.62×102ng/μL、1.62×10ng/μL、1.62ng/μL、1.62×102pg/μL、1.62×10pg/μL、1.62pg/μL、1.62×102fg/μL、1.62×10fg/μL、1.62fg/μL作为模板进行LAMP灵敏度测定,并与常规PCR进行比较。结果表明:25μL反应体系最佳终浓度分别为外引物浓度0.2μmol/L、内引物浓度1.6μmol/L,Mg2+浓度6mmol/L,dNTP浓度0.6mmol/L,甜菜碱浓度0.6mol/L,Bst DNA聚合酶0.08U/μL,反应温度62℃,反应时间60 min。特异性结果表明,只有根串珠霉菌基因组DNA有黄绿色和特异性梯状条带,其他供试菌株DNA无黄绿色且不能检测出任何条带。LAMP检测根串珠霉菌基因组DNA的最低检出浓度为1.62×102fg/μL,比常规的PCR检测高出两个数量级,并且方法简单、节省时间。成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测根串珠霉菌体系,为相关研究和应用提供了技术支持。
类型: 国内会议
作者: 王甲军,李珊珊,窦彦霞,马冠华
关键词: 环介导等温扩增,根串珠霉菌,快速检测
来源: 中国植物病理学会2019年学术年会 2019-07-20
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,农业基础科学,植物保护
单位: 西南大学植物保护学院
分类号: S432.4
DOI: 10.26914/c.cnkihy.2019.020197
页码: 175
总页数: 1
文件大小: 66k
下载量: 42
本文来源: https://www.lunwen90.cn/article/37b0c0d9bf4d58f7737804c5.html