CRISPR质粒和同源重组模板的共转染可降低CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率

论文摘要

目的探讨CRISPR质粒和同源重组模板的共转染对CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率的影响以及可行的解决办法。方法用T7E1内切酶实验和RT-qPCR检测只转染CRISPR质粒组和质粒和模板共转染组细胞内Cas9的切割效率,Cas9 RNA和DNA水平的差异;RT-qPCR检测降低共转染的模板DNA的数量时,细胞内Cas9 DNA和RNA水平的变化;RT-qPCR和T7E1内切酶实验检测先转染CRISPR质粒后转染同源重组模板时,细胞内Cas9 DNA和RNA水平以及切割效率的变化。结果与只转染CRISPR质粒组相比,CRISPR质粒和同源重组模板的共转染显著降低了CRISPR质粒的转染效率（P<0.001）和Cas9的切割效率（P<0.001）。而先转染质粒后转染同源重组模板组和只转染质粒组在CRISPR质粒的转染效率和Cas9的切割效率差别无统计学意义。结论 CRISPR质粒和同源重组模板的共转染降低了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率,而先转染质粒后转染同源重组模板可以解决这一问题。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 质粒与同源重组修复模板:
•     1.1.2 试剂:
•   1.2 方法
•     1.2.1 CRISPR质粒构建:
•     1.2.2 细胞培养:
•     1.2.3 细胞转染:
•     1.2.4 细胞裂解和RT-qPCR检测CRISPR质粒数量:
•     1.2.5 DNaseⅠ处理RNA样品:
•     1.2.6 RNA反转和RT-qPCR检测Cas9转录水平:
•     1.2.7 T7E1实验检测Cas9蛋白切割效率:
•   1.3 统计学分析
• 2 结果
•   2.1 CRISPR质粒和同源重组修复模板共转染降低了CRISPR/Cas9系统的切割效率
•   2.2 CRISPR质粒和同源重组修复模板共转染降低了细胞内Cas9的表达水平和DNA含量
•   2.3 同源重组修复模板对CRISPR质粒的转染效率和表达水平的降低具有浓度依赖性
•   2.4 先转染CRISPR质粒后转染同源重组模板改善了CRISPR系统的切割效率
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 林琼,张祝琴,刘德培

关键词: 系统,共转染,分开转染,同源重组模板

来源: 基础医学与临床 2019年07期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室

基金: 中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2017-I2M-B&R-04),中国医学科学院医学表观遗传中心基金(2017PT31035)

分类号: Q78

DOI: 10.16352/j.issn.1001-6325.2019.07.024

页码: 1048-1054

总页数: 7

文件大小: 1651K

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