雷帕霉素靶蛋白复合物1对Hela细胞微管蛋白稳定性的影响

论文摘要

目的:探讨雷帕霉素靶蛋白复合物1 （mammalian target of rapamycin complex 1,m TORC1）对Hela细胞微管稳定性的影响及可能机制。方法:使用50 nmol/L雷帕霉素预处理Hela细胞24 h后,加入5μmol的诺考达唑处理30、60和120 min,免疫荧光检测微管蛋白的稳定性;使用50 nmol/L雷帕霉素处理Hela细胞24 h后,蛋白质印迹检测促微管解聚蛋白stathmin、KIF2A,促微管聚合蛋白CLIP170,微管切割蛋白Katanin、Spastin的表达变化。转染ATG5-shRNA抑制自噬相关基因5（autophagy-related gene5,ATG5）后,免疫荧光检测微管蛋白稳定性的改变。使用50 nmol/L雷帕霉素预处理Hela细胞24 h后,蛋白质印迹检测Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family member A,Rho A）的表达;转染GFP Rho A-Q63L或GFP Rho A-N19、p190RhoGAP-siRNA质粒后,免疫荧光检测微管稳定性的改变。结果:用雷帕霉素抑制m TORC1的活性后Hela细胞微管的稳定性增强,但微管稳定性相关蛋白stathmin、KIF2A、CLIP170、Katanin、Spastin无明显变化。抑制细胞自噬后,微管的稳定性无明显改变。雷帕霉素抑制m TORC1的活性后Rho A GTP酶的活化水平下调;下调p190RhoGAP的活化水平后,微管的稳定性减弱。结论:Rho A在m TORC1介导的Hela细胞微管稳定性中起重要作用。

论文目录

• 1 材料和方法
•   1.1 材料
•   1.2 细胞培养
•   1.3 免疫荧光检测雷帕霉素处理后Hela细胞的微管稳定性
•   1.4 蛋白质印迹检测雷帕霉素处理后Hela细胞微管稳定性相关蛋白的表达
•   1.5 免疫荧光检测ATG5敲减后Hela细胞的微管稳定性
•     1.5.1 质粒构建
•     1.5.2 蛋白质印迹验证ATG5的干扰效率
•     1.5.3免疫荧光检测微管稳定性
•   1.6 免疫荧光检测RhoA在m TORC1调节微管稳定性中的作用
•     1.6.1 蛋白质印迹检测雷帕霉素处理后Hela细胞RhoA的表达
•     1.6.2 RhoA活化实验
•     1.6.3 RhoA抑制实验
•   1.7 免疫荧光检测p190RhoGAP在m TORC1调节微管稳定性中的作用
• 2 结果
•   2.1 雷帕霉素作用后Hela细胞微管的稳定性
•   2.2 霉帕霉素作用后Hela细胞微管稳定性相关蛋白的表达
•   2.3 ATG5基因敲低后Hela细胞的微管稳定性
•   2.4 Rho A活性在m TORC1调节微管稳定性中的作用
•   2.5 p190RhoGAP在m TORC1调节微管稳定性中的作用
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 毛正发,徐进,季佩宇,王旭青,张建新,周小明

关键词: 雷帕霉素靶蛋白复合物,微管,同源基因家族成员,自噬,细胞

来源: 江苏大学学报(医学版) 2019年06期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技

专业: 基础医学

单位: 江苏大学附属医院普通外科,江苏大学医学院

基金: 国家自然科学基金资助项目(81502372)

分类号: R341

DOI: 10.13312/j.issn.1671-7783.y190162

页码: 467-471

总页数: 5

文件大小: 1130K

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