母乳菌群构成及优势乳酸菌影响幼鼠肠黏膜免疫研究

论文摘要

母乳中的微生物构成决定了新生儿肠道菌群构成,其主要来源于母亲肠道、乳腺皮肤、婴儿口腔等。母乳中的微生物垂直传递至婴儿肠道后,影响后代肠道免疫系统发育。本研究旨在确定母-婴潜在垂直传递有益菌,探究分离菌株对子代肠道免疫能力的影响机制,主要内容如下:首先,收集13名乳母母乳（初乳、过渡乳、成熟乳）、同期配对婴儿粪便,成熟乳期乳母粪便,并富集sIgA包裹菌。根据16s rDNA结果,成熟乳与同期婴儿粪便菌群多样性及构成最相似。Cluster聚类分析显示,成熟乳中优势sIgA包裹传递菌主要为Streptococcus、Staphylococcus、Lactobacillus（Lactobacillus-gasseri）、Enterococcus、Bifidobacterium（Bifidobacteriumlongumsubsplongum）、Klebsiella、Ambigous和Escherichia-Shigelle。另外,分娩期摄入抗生素影响母乳、婴儿粪便及它们的sIgA包裹菌构成的,显著提高母乳中Staphylococcus、Pseudomonas和Gemmiger,而显著降低Escherichia-Shigelle、Klebsiella和Chryseobacterium。抗生素显著提高了婴儿粪便中Klebsiella和Escherichia-Shigelle的相对含量,而降低Enterococcus和Rothia的相对含量。抗生素治疗后母乳sIgA包裹菌中的Pediococcus和Carnobacterium显著增多,而Streptococcus和Klebsiella显著降低。抗生素干预后婴儿粪便sIgA包裹菌中Klebsiella和Lactobacillus相对降低,而Carnobacterium相对丰度增多。其次,利用组合培养基（MRS+YCFA）养了全国11个城市42nd d母乳细菌,菌群测序分析显示,这些样本的菌群构成存在明显地理特异性,S.salivarius出现率最高（26%）,L.reueri,L.gasseri,L.casei和L.fermantation具有地区特异性,其余乳杆菌没有区域特异性。最后,分离潜在垂直传递菌种,获得了4株唾液链球菌（母乳源）和1株罗伊乳杆菌（母乳源）,4株植物乳杆菌（婴儿粪便源）,分别选择每种细菌中菌体疏水性、粘附性和自动聚集能力较强的菌株进行动物实验。动物实验为繁育实验,母鼠与公鼠按3:1合笼交配分娩后,哺乳期母鼠分为四组,正常组（CON）,S.salivarius灌胃组（SS）,L.plantarum灌胃组（LP）和L.reuteri灌胃组（LR）,3 w断奶后,处死母鼠组（n=5）及对应组雌雄幼鼠（每组n=5）,其余幼鼠按照正常组（C-C）,仅干预母代（SS-C、LP-C和LR-C）,仅干预子代（C-SS、C-LP和C-LR）,同时干预母代和子代（SS-SS、LP-LP和LR-LR）进行分组,干预至5 w。结果表明:细菌处理不同程度提高了乳期母鼠血清中相关免疫球蛋白含量,降低了肠粘膜通透性（FD4降低）,提高了小肠内容物分泌性免疫球蛋白A（sIgA）含量。三种菌株均提高了母鼠肠道黏膜屏障及抗菌肽相关基因mRNA表达量,但只有LR提高了肠道IgA产生通路部分基因mRNA表达。干预母鼠后,3 w子代小鼠血清中IgA、IgE和IgG2a含量提高,FD4含量降低,小肠内容物sIgA含量升高,并上调了肠道抗菌肽,黏膜屏障及IgA通路不同基因mRNA表达量。这些作用效果在雄性子代小鼠更明显;三株细菌在三种干预方式中对5 w子代小鼠的影响趋势与3 w子代小鼠相似。但同时干预母代和子代小鼠效果更明显。总之,母乳与婴儿菌群垂直传递通过sIgA介导传递的潜在有益菌主要为Streptococcus、Lactobacillus（Lactobacillus-gasseri）、Enterococcus和Bifidobacterium（Bifidobacteriumlongumsubsplongum）。母亲或婴儿服用抗生素会降低母乳及婴儿粪便菌群多样性,提高丰富度,改变潜在垂直传递菌群构成及相对含量。全国母乳可培养菌群构成及多样性具有地域差异性,潜在垂直传递菌中优势出现率菌种为S.salivarius,L.reuteri、L.gasseri、L.fermentation和L.casei的检出情况具有地区特异性。哺乳期母鼠摄取潜在传递菌S.salivarius、L.reuteri和L.plantarum可间接促进子代肠粘膜免疫和肠绒毛发育。对调节乳母及婴儿肠道微生物专用营养开发产品具有指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 母乳菌群构成
•   1.2 母乳菌群构成影响因素
•     1.2.1 产前环境
•     1.2.2 分娩方式
•     1.2.3 饮食习惯
•     1.2.4 抗生素影响
•     1.2.5 其他因素
•   1.3 母乳菌群来源及母婴菌群垂直传递
•     1.3.1 母乳菌群来源
•     1.3.2 母婴垂直传递
•   1.4 婴儿肠道菌群构成
•   1.5 母乳菌群益生功能
•   1.6 立体意义和主要内容
•     1.6.1 立题意义
•     1.6.2 主要内容
• 2 材料与方法
•   2.1 实验设计与设备
•     2.1.1 实验样品
•     2.1.2 实验主要试剂
•     2.1.3 试剂制备
•     2.1.4 实验主要设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 样品前处理
•     2.2.2 免疫磁珠法富集分离sIgA包裹菌
•     2.2.3 细菌基因组DNA提取
•     2.2.4 16S rDNA高通量测序（NGS）
•     2.2.5 菌群种水平实时荧光定量PCR（qPCR）
•     2.2.6 灌胃菌株的确定
•     2.2.7 动物实验设计
•     2.2.8 组织收取
•     2.2.9 指标测定
•   2.3 数据分析
• 3 结果与讨论
•   3.1 健康母亲和对应婴儿粪便及母亲粪便菌群构成
•     3.1.1 志愿者信息
•     3.1.2 母乳、婴儿粪便、母亲粪便菌群多样性分析
•     3.1.3 母乳、婴儿粪便、母亲粪便菌群构成
•     3.1.4 母亲BMI与母乳及母亲粪便菌群皮尔森相关性分析
•     3.1.5 阶段乳及对应婴儿粪便多样性分析
•     3.1.6 阶段乳及对应婴儿粪便菌群构成
•     3.1.7 初乳和母亲粪便与产前血常规皮尔森相关性分析
•     3.1.8 初乳和母亲粪便与产后血常规皮尔森相关性分析
•     3.1.9 初乳和母亲粪便与产前血生化皮尔森相关性分析
•     3.1.10 菌群出现率分析
•     3.1.11 sIgA包裹菌多样性分析
•     3.1.12 sIgA包裹菌群构成分析
•     3.1.13 垂直传递菌构成
•   3.2 抗生素对母乳及婴儿粪便菌群及潜在垂直传递菌的影响
•     3.2.1 志愿者信息
•     3.2.2 抗生素对母乳及婴儿粪便菌群多样性影响
•     3.2.3 抗生素对母乳及婴儿粪便菌群构成影响
•     3.2.4 sIgA包裹菌多样性
•     3.2.5 sIgA包裹菌菌群构成
•     3.2.6 抗生素对母乳、婴儿粪便及sIgA包裹菌的影响
•   3.3 母乳菌群地区差异性构成及潜在垂直传递乳酸菌出现率
•     3.3.1 志愿者信息
•     3.3.2 体外培养基选择
•     3.3.3 母乳样品特征
•     3.3.4 母乳菌群地区分布及多样性特征
•     3.3.5 母乳菌群出现率及区域特点
•   3.4 潜在垂直传递菌种对幼鼠肠粘膜免疫功能调节
•     3.4.1 灌胃菌株的选择
•     3.4.2 S.salivarius体内安全性评价
•     3.4.3 乳酸菌对母鼠血清免疫球蛋白及FD4 含量的影响
•     3.4.4 乳酸菌对母鼠小肠内容物sIgA含量的影响
•     3.4.5 乳酸菌对雌雄幼鼠血清免疫球蛋白及FD4 含量的影响
•     3.4.6 乳酸菌对雌雄幼鼠小肠内容物sIgA含量的影响
•     3.4.7 乳酸菌对母鼠及幼鼠黏膜免疫与屏障基因表达
•     3.4.8 乳酸菌对母鼠肠道IgA+浆细胞数量及分布影响
•     3.4.9 乳酸菌对雌雄幼鼠肠道IgA+浆细胞数量及分布影响
•     3.4.10 三种乳酸菌对母鼠肠道形态结构的影响
•     3.4.11 乳酸菌对雌雄幼鼠肠道形态结构的影响
•     3.4.12 乳酸菌对幼鼠先天性免疫细胞表达影响
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 丁梦帆

导师: 孙进

关键词: 垂直传递,包裹菌,乳酸菌,子代,粘膜免疫

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,医药卫生科技

专业: 生物学,轻工业手工业,预防医学与卫生学

单位: 江南大学

分类号: R153.1;TS201.3

总页数: 95

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