导读:本文包含了转基因沉默论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:基因,转基因,沉默,氧化酶,毒蛾,蛋白,生长素。
转基因沉默论文文献综述
芮鹏环,宋培培,蒋磊,江彤[1]（2019）在《沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草》一文中研究指出【目的】本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T_1代转基因抗CMV株系。【方法】构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b(r)-In-2b(i),以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草(Nicotiana tabacum)品种云烟85。【结果】抗性筛选获得112株T_0代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T_0代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T_0代抗病烟株的病毒积累量显着低于感病烟株。选取10个T_0代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T_1代抗病性,发现部分T_1代烟株发生一定比例的抗感分离,T_1代抗性株率为46.7%～100%。Real-time PCR检测T_1代烟株,发现T_1代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显着低于感病烟株。【结论】基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。(本文来源于《中国烟草学报》期刊2019年01期）
董阳婷,曹坤,向洁,徐毅,谭龙春[2]（2018）在《沉默信息调节因子1对抗APP高表达转基因小鼠脑组织及β-淀粉样肽寡聚体处理的原代培养神经元中氧化应激水平升高的作用》一文中研究指出目的:由于氧化应激水平升高是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的可能性发病机制之一,而沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的功能与抗氧化有关,本文试图了解SIRT1是否能对抗β-淀粉样肽前体蛋白(APP)高表达的小鼠大脑或经β-淀粉样肽寡聚体(AβOs)处理的神经元中氧化应激水平的升高。方法:APP/PS1双转基因种鼠与野生型(WT)雌鼠合笼繁殖,筛选出APP/PS1双转基因小鼠,分别饲养至4月龄或8月龄时,用白藜芦醇(RSV,SIRT1激活剂)或苏拉明(SIRT1抑制剂)通过灌胃方法处理转基因小鼠,每次20 mg·kg~(-1)体重/天,时间2个月;采用原代海马神经元培养,用0.5μmol·L~(-1) AβOs处理48小时后分别用20μmol·L~(-1)RSV或300 mg·mL~(-1)苏拉明处理细胞24小时。采用CCK-8方法检测细胞存活率,筛选最佳药物处理浓度;用蛋白印记及实时定量PCR方法分别检测SIRT1蛋白和mRNA表达水平;用免疫组织化学方法检测APP高表达转基因小鼠脑组织内老年斑分布情况;用激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测原代海马神经元中活性氧(ROS)水平;用生物化学方法检测小鼠脑组织及细胞中OH~-、H_2O_2、O2_.~-水平,丙二醛(MDA)含量,以及超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果:与WT小鼠或未经处理的原代神经元相比,APP/PS1小鼠大脑或经AβOs处理的神经元中SIRT1的表达显着降低;小鼠脑组织中老年斑数量明显增加;脑组织及培养神经元中氧化应激水平明显升高,抗氧化酶水平明显降低。APP/PS1小鼠大脑或经AβOs处理的神经元中这些异常改变可通过RSV处理后减弱,而用苏拉明处理后则使其增强。结论:SIRT1可以降低APP高表达小鼠大脑及经AβOs处理的神经元中的氧化应激水平,具有神经保护作用。(本文来源于《神经药理学报》期刊2018年02期）
[3]（2017）在《"基因沉默"让美转基因苹果切开叁周不变色》一文中研究指出北极苹果会在切开叁周后不变色,为什么?"苹果细胞中的叶泡中含有一些不寻常的有机物——多酚类,细胞器叶绿体和线粒体中则含有多酚氧化酶。正常情况下两者分处不同场所,不会相遇。"中科院遗传与发育研究所生物学研究中心高级工程师姜韬说,当苹果被切开或细胞受损,多酚氧化酶与多酚类就会相遇,这时前者就利用空气中的氧气,把多酚类氧化生成醌类物质,然后(本文来源于《商业文化》期刊2017年31期）
马爱平[4]（2017）在《“基因沉默”让美转基因苹果切开叁周不变色》一文中研究指出“北极苹果（Arctic apples）是2017年2月在美国中西部少数几个州销售的，这个月计划开始在加州销售，可能是切成片装袋销售，预计2017年年底会在美国其他区域开始销售。”15日，美国北卡罗莱纳大学医学院药理系博士后任金琪告诉科技日报记者。(本文来源于《科技日报》期刊2017-10-16）
倪炯,王培军,梁挺[5]（2017）在《RNA干扰沉默P2X7受体治疗APP/PS1转基因小鼠的实验研究》一文中研究指出目的检测RNA干扰沉默P2X7R对APP/PS1转基因小鼠的治疗效果,探讨P2X7R作为RNA干扰治疗AD治疗靶点的可行性。方法以9月龄APP/PS1转基因小鼠和同月龄的阴性纯合子小鼠为研究对象,通过颅内注射Lenti-siP2X7R将siRNA引入小鼠脑内。用Real-Time PCR和Western blotting检测小鼠脑内P2X7R的mRNA和蛋白表达水平。通过水迷宫行为学测试检测各组小鼠的学习记忆能力;通过氢质子磁共振波谱检测小鼠海马区域N-乙酰天门冬氨(本文来源于《中国中西医结合学会医学影像专业委员会第十五次全国学术大会暨上海市中西医结合学会医学影像专业委员会2017年学术年会暨《医学影像新技术的临床应用》国家级继续教育学习班资料汇编》期刊2017-07-14）
王爽[6]（2017）在《利用转基因RNAi技术沉默稻纵卷叶螟膜结合型海藻糖酶基因》一文中研究指出水稻(Oryza sativa)对于全球人们来说是一种重要的粮食作物,目前已经有有超过1/2的人是以大米为食。但是,我国的水稻产量并不丰富,究其主要原因是虫害。在我国威害水稻的害虫已知的有350多种,常见的有30多种,主要包括食叶类、钻蛀类、吸汁类、食根类这4大类害虫,其中稻纵卷叶螟危害较为严重。稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)属于鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae),俗称卷叶虫,刮青虫、苞叶虫等,。海藻糖酶是昆虫体内海藻糖代谢的一个要害酶,同时,海藻糖也是昆虫重要的血糖物质,因而其在昆虫能量的调节以及昆虫的发育过程中具有不能漠视的作用,尤其在昆虫飞行的过程中,是昆虫飞行的主要能量储存物质。因而海藻糖酶也就天然的成为了害虫管制的理想靶标。截至目前,科研工作者发现海藻糖酶基因的类型有两种,分别属于可溶性海藻糖酶基因(Tre1)和膜结合型海藻糖酶基因(Tre2)。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA在进化过程中高度保守的、高效特异性降解的现象。本研究的主要目标是通过体外注射dsRNA的方法来导致RNAi的现象,从而实现降低稻纵卷叶螟海藻糖酶基因的表达以及利用转基因RNAi技术,以取得对稻纵卷叶螟膜结合型海藻糖酶基因具有缄默作用的转基因水稻植株,从而达到控制稻纵卷叶螟危害的目的,为稻纵卷叶螟的生物防治奠定根底。取得的主要研究结果如下:1.注射dsRNA干扰稻纵卷叶螟海藻糖酶基因的表达以稻纵卷叶螟膜两种藻糖酶基因(膜结合型海藻糖酶基因和可溶型海藻糖酶基因)为靶标,设计两个靶位点以实现对稻纵卷叶螟膜结合型海藻糖酶基因和海藻糖酶基因的RNAi效应,并将两个靶位点分别命名为CmTreⅡ*和CmTre*。采用RNAi技术,在体外合成两个dsRNA(CmTreⅡ-dsRNA和CmTre-dsRNA)。通过显微注射的方法分别将CmTreⅡ-dsRNA和CmTre-dsRNA导入稻纵卷叶螟3龄幼虫体内。观察发现,在注射CmTreⅡ-dsRNA和CmTre-dsRNA后稻纵卷叶螟幼虫对水稻的取食情况有较为显着的下降,生长发育情况也出现了明显的滞后,有的出现蜕皮受阻等现象。而且注射CmTreⅡ-dsRNA和CmTre-dsRNA的稻纵卷叶螟的虫体明显相较于对照组又小又黑,有的甚至出现了畸形的虫体,更甚者出现死亡等情况。RT-qPCR结果表明,注射了CmTreⅡ-dsRNA和CmTre-dsRNA的稻纵卷叶螟幼虫在96 h后,海藻糖酶基因的表达量相比对照组分别下降了48.33%和71%;在注射PBS溶液、CmTreⅡ-dsRNA和CmTre-dsRNA 7 d后,稻纵卷叶螟幼虫的死亡率分别为23.33%,63.33%和83.33%,与对照组相比分别增加了11.66%,51.66%和71.66%,且各组的校正死亡率为13.18%、58.50%和82.26%(P<0.05)。2.重组RNAi植物表达载体的构建与鉴定同样的,以CmTreⅡ和CmTre两个基因片段为靶位点,分别在其两端添加Spe I和BamH I酶切位点,进行人工合成,然后经双酶切后与植物表达载体p1301连接,构建p1301-CmTreⅡ*和p1301-CmTre*两个重组植物表达载体。通过PCR、双酶切及测序鉴定的方法验证重组表达载体p1301-CmTreⅡ*和p1301-CmTre*已构建成功,并采用液氮冻融的方法将其成功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。3.转基因水稻的获得使中花11号粳稻的愈伤组织被分别含有p1301-CmTreⅡ*和p1301-CmTre*质粒的农杆菌LBA4404浸染,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生,总共获得17株转基因再生植株。通过靶标位点的RT-PCR检测,其结果表明:7株是含有CmTreⅡ的阳性转基因植株,9株是含有CmTre的阳性转基因植株。1株转基因失败,舍去。4.RNA干扰效应的检测将取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟设置为对照组,观察发现取食了转基因水稻的稻纵卷叶螟的取食情况以及生命活性都有了不同程度的下降现象,同时稻纵卷叶螟的生长发育情况也出现了不同程度的滞后,有的甚至出现了蜕皮受阻等现象。而且取食转基因水稻的稻纵卷叶螟的虫体明显相较于对照组又小又黑,有的甚至出现了畸形的虫体,更甚者出现死亡等情况。取食转基因水稻的稻纵卷叶螟体内海藻糖酶基因的mRNA的表达水平通过实时荧光定量PCR方法(RT–PCR)来测定,并统计稻纵卷叶螟的死亡情况。结果显示:相较于取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟,取食转入目的基因片段CmTreⅡ的水稻的稻纵卷叶螟膜结合型海藻糖酶基因平均相对表达量下降了29%;取食转入目的基因片段CmTre水稻的稻纵卷叶螟的海藻糖酶基因平均相对表达量下降了55%,死亡率也分别增加了46.67%(取食转CmTreⅡ基因的水稻)和66.67%(取食转CmTre基因的水稻),校正死亡率分别为51.85%(取食转CmTreⅡ基因的水稻)和74.67%(取食转CmTre基因的水稻)。转CmTreⅡ基因的水稻和转CmTre基因水稻的室外抗虫性的试验结果表明:稻纵卷叶螟对两种转基因水稻的取食量都有显着下降,表现为转CmTreⅡ基因水稻的卷叶率和白叶率分别为13.40%和12.47%,转CmTre基因水稻的卷叶率和白叶率分别为12.61%和11.84%,相比对照组(即取食非转基因水稻)卷叶率分别下降了11.32%(转CmTreⅡ基因的水稻)和12.11%(转CmTre基因的水稻);白叶率分别下降了10.10%(转CmTreⅡ基因的水稻)和10.73%(转CmTre基因的水稻);研究结果表明转CmTreⅡ基因的水稻和转CmTre基因的水稻的RNA干扰效应都十分地显着,能对取食其叶片的稻纵卷叶螟的海藻糖酶基因起到非常明显的缄默作用,而且稻纵卷叶螟对转基因水稻表现出明显的拒食性。(本文来源于《贵州大学》期刊2017-06-30）
刘斯超,许涛,董秀芬,付欣,郑鹏靖[7]（2017）在《番茄SlIAA16沉默转基因植株的获得及功能初探》一文中研究指出Aux/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)作为生长素早期响应因子,其蛋白产物能够特异性地结合生长素响应因子(auxin response factor,ARF),从而调控生长素响应基因的表达,在整个植物生长素信号转导过程中发挥着重要的作用,进而影响植物的生长发育。本研究通过构建沉默载体,在高效遗传转化体系下获得转基因植株,发现利用Gateway克隆技术将番茄生长素早期响应基因Sl IAA16 DomainⅡ区部分序列连入具有正反2个attr区域并连接1个内含子的p B7GWIWG2(Ⅰ)载体,可在植株体内形成发卡结构导致植物基因沉默,成功构建基因沉默表达载体名为Sl IAA RNAi;此外,抗生素喷施和PCR扩增以及实时定量检测进一步鉴定,共获得12棵Sl IAA16 RNAi阳性植株。本研究结果将为进一步明确Sl IAA的生物学功能和阐明生长素的作用机理提供参考。(本文来源于《江苏农业科学》期刊2017年05期）
问荣荣[8]（2017）在《RNAi介导的舞毒蛾USP基因沉默及转基因植物抗虫性研究》一文中研究指出舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)是一种分布较广、食性杂、危害严重的世界性重要农林食叶害虫。长期以来,舞毒蛾的防治主要依赖于化学农药,化学农药的频繁使用已引起害虫抗性形成、高残留和环境污染等问题。高效、环境友好型防治策略的探寻迫在眉睫。随着分子生物学的快速发展,分子靶标的运用将会促成新的防治害虫策略的形成。理想的分子靶标是参与机体至关重要功能的基因产物,通过干扰这类基因的表达能严重影响害虫正常生理机制,能够成功表达靶标基因的dsRNA的转基因植物使得在野外害虫控制中使用RNAi技术成为可能。本研究以农林食叶害虫舞毒蛾(L,dispar)为对象,利用高通量测序技术,进行了植物源杀虫剂鱼藤酮亚致死剂量处理和对照组转录组中差异表达基因分析,筛选出舞毒蛾体内表达显着下调的超气门蛋白基因(LdUSP)。超气门蛋白(USP)和蜕皮激素受体(EcR)组成的异源二聚体在蜕皮激素信号转导过程中起到至关重要的作用。蜕皮激素和保幼激素共同调节复杂着蜕皮和变态两大生理反应,超气门蛋白基因(LdUSP)在昆虫完全变态过程中的分子作用调控机制中具有重要作用。在杀虫剂鱼藤酮的胁迫下，USP基因表达受到抑制,USP基因可能成为理想靶标基因。本研究利用RNAi技术进行LdUSP基因功能分析,进一步构建LdUSP基因dsRNA植物表达载体,探究转基因植株抗虫性,对于新防治策略的形成具有非常重要的意义。具体研究结果如下:1、采用点滴法测定鱼藤酮对舞毒蛾3龄幼虫12、24、36和48 h致死中浓度LC50分别为14.10、10.44、9.75和9.51 mg/L,且随着作用时间的增加鱼藤酮毒性越大。根据毒力测定结果,计算出亚致死剂量并利用其处理舞毒蛾幼虫。结果表明,鱼藤酮对舞毒蛾 3 龄幼虫 12hLC10、LC20、LC30、LC40分别为 3.80、5.96、8.24 和 10.88mg/L;24h LC10、LC20、LC30、LC40h分别为 3.61、5.20、6.76 和 8.47 mg/L;36 h LC10、LC20、LC30、LC40分别为 3.15、4.65、6.14 和 7.80 mg/L;48 h LC10‘LC20、LC30、LC40分别为2.83、4.29、5.79和7.48 mg/L。低剂量鱼藤酮药液对舞毒蛾幼虫生长具有抑制作用。2、采用IlluminaHiSeq2500高通量测序,分别构建鱼藤酮(4mg/L)和对照组舞毒蛾3龄幼虫转录组,获得10.23Gb数据,组装共得到103492条Transcript和74772条Unigene,长度大于 1 kb 为 12239 条。Transcript 与 Unigene 的 N50 分别为 1976 和1146。在4 mg/L鱼藤酮胁迫处理和对照组的差异表达分析中获得差异表达基因710条,其中下调基因325条,上调基因有385条,注释到COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot和Nr数据库中共有576条,对应的各功能数据库基因数分别为222、257、160、352、449、404和548条。注释到GO数据库的差异表达基因257个,其中注释到细胞成分、分子功能、生物过程的差异表达基因数分别为107、212和188;注释到COG数据库的222个差异表达基因中,General function prediction only功能基因最多,含67条。3、在舞毒蛾转录组文库分析基础上,利用RT-PCR技术克隆获得LdUSP基因cDNA全长序列。对舞毒蛾LdUSP基因全长cDNA及其推导气基酸序列分析表明LdUSP基因阅读框(ORF)长1395bp,含464个氨基酸,该蛋白中相对含量最多的氨基酸是亮氨酸(leu)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg),分别含有53、39、37个,分别占总氨基酸数11.4%、8.4%、8.0%。舞毒蛾LdUSP基因属于核受体家族成员,舞毒蛾LdUSP蛋白不含信号肽序列,具有亲水性。多序列比对结果显示该蛋白拥有典型的核受体特征和结构单元(A/B,C,DandE/F结构域)。系统进化树分析表明,舞毒蛾LdUSP蛋白氨基酸序列与已经报道的麟翅目昆虫基因序列相比,均具有较高的同源性,舞毒蛾LdUSP与小地老虎USP(Agrotis ipsilonAGA17964.1)亲缘关系最近。4、采用RT-qPCR法分析LdUSP基因在舞毒蛾3龄幼虫期的时空特异表达及在发育过程中的表达特异性,结果显示，LdUSP mRNA在舞毒蛾3龄幼虫期的0-48 h阶段内表达水平较高且比较稳定,在60-108 h表达起伏相间波动较大,在整个3龄期表达最高峰出现在72 h,差异显着;LdUSP基因在各个发育期均有表达,且不同龄期间具有差异性,舞毒蛾LdUSP基因在雄虫中的表达量最高,在卵、预蛹和蛹期表达量较低。RT-qPCR检测结果显示,舞毒蛾LdUSP基因在胸和腹部的表达量高于头部,在胸部表达量最高。采用RT-qPCR法分析LdUSP基因对植物源杀虫剂鱼藤酮的胁迫响应,结果显示,在4、10、20 mg/L的鱼藤酮剂量处理后舞毒蛾Ld USP基因表达显着下调,且随鱼藤酮浓度增加,其抑制效果加强。5、通过PCR法克隆获得舞毒蛾LdUSP基因的叁个片段序列,其中LdUSP-1大小为508 bp(位于 447bp-954bp)，LdUS-大小为 514 bp(位于 806bp-1320bp),LdUSP-3大小为477 bp(位于52bp-528bp)。RNAi技术将舞毒蛾LdUSP基因特异的dsRNA(dsRNAUSP-1、dsRNAUSP-2和dsRNAUSP-3)通过取食导入舞毒蛾3龄幼虫体内获得基因沉默舞毒蛾,测定取食dsRNA 12、24、36、48、72 h后靶标基因mRNA的相对表达量。研究结果显示:通过取食dsRNA可以有效的沉默LdUSP基因,dsRNAUSP-3沉默效果最好。实时荧光定量PCR技术分别分析了 dsRNAUSP-1,dsRNAUSP-2,dsRNAUSP-3对舞毒蛾蜕皮激素应答相关基因(E74、E75、FTZ-F1)和能够编码蜕皮激素合成酶的Halloween基因(Shd、Sad、Phm)表达量的影响,结果显示,取食dsRNAUSP-1,dsRNAUSP-2,dsRNAUSP-3 后基因E74、E75、FTZ-F1、shd、Sad 和Phm的表达均显着下调,说明LdUSP基因对蜕皮激素应答相关基因具有直接或间接性的调控作用,并对Halloween基因具有直接或间接的反馈调节作用。舞毒蛾3龄幼虫摄取dsRNAUSP-l和dsRNAUSP-2后,舞毒蛾3龄历期分别缩短了 0.72和0.83 d,而摄取dsRNAUSP-3使得舞毒蛾3龄历期延长0.32 d。与对照组(RNase-free water)相比,连续取食2 μg/d dsRNAUSP-3 8天后,舞毒蛾3龄幼虫鲜重持续逐减,变化不显着,但幼虫累计死亡率(46.67%)明显高于对照组(13.33%)。6、基于转基因杨树技术成功构建了表达LdUSP基因dsRNA的植物表达载体,并获得转基因84K杨。转基因植株抗虫性结果显示,舞毒蛾3龄幼虫取食转基因84K杨树叶片后,通过RT-qPCR检测发现取食12、24、36、48和72h后幼虫体内目标mRNA表达水平均有不同程度的下降。舞毒蛾3龄幼虫连续取食转基因植株叶片6d,幼虫鲜重有所减轻,但差异不显着。未发现明显的表型异化,具有死亡现象,转基因处理组死亡率为16.67%,对照组死亡率为3.33%。以上结果表明舞毒蛾LdUSP基因能够对杀虫剂鱼藤酮的胁迫产生响应,RNAi介导LdUSP基因功能分析表明LdUSP基因对蜕皮激素应答相关基因具有直接或间接性的调控作用,并对Halloween基因具有直接或间接的反馈调节作用。该基因的沉默虽然没有引起幼虫鲜重的变化,但是能够造成幼虫存活率的降低。表达LdUSP基因dsRNA的转基因植株物能够降低舞毒蛾体内靶标基因的mRNA水平,具有一定的抗虫性,为开辟新的舞毒蛾防治途径奠定了理论基础。(本文来源于《东北林业大学》期刊2017-03-01）
诺明途[9]（2016）在《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》一文中研究指出转基因沉默(Transgenic Silencing)现象普遍存在于转基因动植物上,因而给转基因动物的培育和应用价值带来了新的难题。目前,学界对转基因沉默现象及其发生机制进行了广泛的研究。从所报道的转基因沉默的例子来看,几乎所有的转基因沉默现象都与外源启动子的甲基化、组蛋白乙酰化异常及外源基因拷贝数有关。在过去5年时间里,本实验室累计获得了上百只携带报告基因DsRed(Red fluorescence protein from Discosoma sp.海葵红色荧光蛋白)的PO代转基因白绒山羊,其中一部分存在转基因沉默的现象。转基因沉默现象会严重制约转基因动物外源基因的有效表达,对转基因沉默现象的机理进行研究,并对其提出可能的解决方案,可以为今后提高转基因动物外源基因的表达效率提供实验依据。本研究从以上转基因白绒山羊中选取了有代表性的6只进行研究,培养其耳尖成纤维细胞,以及一部分表皮来源的细胞。研究发现,在荧光激发器激发下,与对照组相比,在部分成年转基因白绒山羊个体及所采细胞样品中均检测不到红色荧光,这与CMV启动子的特性并不相符,表明发生了转基因沉默现象。经过对选取的转基因白绒山羊检测发现,其基因组中均具有完整的外源DsRed基因表达框。实时荧光定量PCR的结果显示,仅在编号为ZK110321的个体中DsRed mRNA较其他个体表达量稍高,但仍低于核供体细胞CFC3-KI的表达水平。Western Blot的检测结果显示,只有ZK110324-1个体和CFC3-KI细胞可以检测到DsRed蛋白的表达。并且根据来自ZK0311-1和ZK110324-1个体的成纤维细胞和表皮细胞的DsRed mRNA表达量的不同的结果可以推断,CMV启动子在白绒山羊不同组织中的沉默程度有所不同。通过实时荧光定量技术的绝对定量方法获得了6只转基因白绒山羊的外源基因拷贝数,但均与DsRed表达量无显着相关性,排除了外源基因拷贝数对DsRed基因表达量的影响。通过重亚硫酸氢盐测序的方法对转基因白绒山羊进行CMV启动子的甲基化状态的研究。本实验中6只健康转基因白绒山羊和未经克隆的核供体细胞CFC3-KI外源CMV启动子的甲基化状态数据显示,有4只成体转基因白绒山羊的外源基因启动子处于很高的甲基化状态(77.4%-88.2%)有一只处于中等偏高的甲基化状态(58.7%),有一只转基因白绒山羊外源基因启动子处于较低的甲基化状态(21.0%),未经克隆的核供体细胞甲基化程度很低(14.3%)。将以上数据与DsRed基因的表达情况关联分析后发现,转基因白绒山羊外源基因的表达水平与启动子的甲基化状态呈显着负相关。因此外源CMV启动子的甲基化水平高是外源基因沉默的主要原因。为使转基因白绒山羊细胞中发生沉默的外源基因恢复表达,本实验采用了甲基化酶抑制剂5氮杂胞苷(5-Azacytidine,5-Az)和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)处理的方法培养转基因白绒山羊细胞。首先以ZK0311-1和ZKl 10324-1个体的成纤维细胞和表皮细胞进行了最适药物浓度的筛选,结果为：处理成纤维细胞最适5-Az浓度为5μmol/L,TSA浓度为5μmol/L,处理表皮细胞的最适5-Az浓度为20μmol/L,TSA浓度为1μmol/L。5-Az的处理时间为7d,TSA的处理时间为24h。之后使用该浓度处理其他转基因白绒山羊耳尖成纤维细胞后获得了良好的外源DsRed基因恢复表达的效果,经5-Az的处理,使ZK110324-2耳尖成纤维细胞中DsRed mRNA的表达量提高了50.19倍；经TSA的处理,使ZK0311-1耳尖成纤维细胞中DsRed mRNA的表达量提高了15.08倍。另对5-Az处理组的6只转基因白绒山羊耳尖成纤维细胞及核供体细胞外源CMV启动子的甲基化水平进行了检测,结果表明ZK0311-1、ZK110324-1和ZK110324-2的耳尖成纤维细胞CMV启动子的甲基化水平都有显着下降,验证了5-Az降低外源基因启动子甲基化水平的有效性。在药物最适浓度筛选实验中TSA浓度与DsRed mRNA的表达量与呈剂量依赖型关系,推断组蛋白乙酰化异常也是导致转基因白绒山羊外源基因沉默的原因之一。对所获得的两只在全身和细胞水平均未表达红色荧光蛋白的转基因白绒山羊(ZK0310-1和ZK0311-1)耳尖成纤维细胞进行体细胞克隆,经过卵母细胞的综合重编程作用,红色荧光在核移植重构胚胎中获得了恢复表达。通过以上实验我们得出：转基因白绒山羊不同个体中外源基因表达并不相同,甚至发生外源基因沉默,这与外源基因的CMV启动子的甲基化以及转基因动物的组蛋白异常乙酰化有关；CMV启动子在转基因白绒山羊不同组织中的沉默程度有所不同；甲基化酶抑制剂5-Az以及去乙酰化酶抑制剂TSA的处理对转基因白绒山羊细胞的外源基因表达模式又有一定的改变作用,且使用TSA和5-Az进行处理是提高外源基因表达效率的有效措施；将外源基因沉默的转基因白绒山羊细胞作为供体细胞进行体细胞克隆也有助于外源基因的恢复表达。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2016-05-17）
曾亚[10]（2016）在《miR168a沉默转基因低结实率水稻突变体的基因组学分析》一文中研究指出水稻是世界上重要的粮食作物之一,又是禾谷类作物功能基因组学研究的模式植物。结实率与产量性状密切相关,在水稻遗传育种和生产中一直备受重视。本研究从T-DNA(MIM164c、OE164c、MIM168a、OE168a)插入常规水稻kasalath获得的转基因株系中,筛选到一个结实率与野生型相比明显偏低的MIM168a转基因株系(3)19-9-4(以下简称(3)19-9-4)。在此基础上,本文以野生型为对照,对该株系进行了花粉育性和活力检测;通过全基因组重测序(WGR)比对,分析了该株系与野生型在基因组学上的差异,试图为进一步探讨水稻结实性状的分子机制提供理论依据。主要结果如下:1.对已创建的外源T-DNA(MIM164c、OE164c、MIM168a、OE168a)插入常规水稻kasalath获得的转基因株系的T1至T5代株系进行广泛的田间生物学性状观察和筛选,获得了多类突变表型株系,包括株高、分蘖数、叶片形状、抽穗期、粒形、有效穗数量、千粒重、种子萌发力等与野生型相比出现明显差异的类型,其中结实率明显降低的突变体(3)19-9-4最引人关注。2.(3)19-9-4与野生型相比,其生育期延长、株高变矮、茎杆纤细易倒伏、分蘖增多、谷粒变小;且(3)19-9-4的花药不饱满;花粉育性低于野生型70%,结实率比野生型低42%。3.以日本晴全基因组为参照,对(3)19-9-4及野生型进行了全基因组重测序(WGR)比对分析。(3)19-9-4及野生型的重测序总序列数分别为91,410,984和88,022,138,测序深度分别为22.7x和23.2x,质量分数分别为93.99%和92.61%;与nipponbare基因组(430mb)比对的覆盖度分别达到89.88%和89.77%,总匹配率分别达到67.35%和71.71%,匹配唯一位置分别占46.3%和49.69%,完全匹配分别占比21.06%和22.19%。对比野生型,(3)19-9-4特有的变异总数为1,618,456个,其中10号染色体上特有的变异位点频率最高,为520个变异/100kb,变异频率最少的是2号染色体为377个变异/100kb。(3)19-9-4总碱基转换(transitions,ts)数(包含t/c和a/g)为2,259,837个,比野生型多105,060个,其中t/c间转换数比野生型多53,603;(3)19-9-4碱基颠换总数(tv)为928,351,比野生型多47,532个;与野生型差量最大是t突变为a数为14,310个。(3)19-9-4中snps和indels共导致864个stopgain(基因终止子获得)和363个stoploss(基因终止子丢失)的功能变化,比野生型分别多出44个和16个;(3)19-9-4中snps导致非同义突变(nonsynonymoussnv)51,727个,比野生型多1,665个,(3)19-9-4中indels导致非移码插入(nonframeshiftinsertion)873个,非移码缺失(nonframeshiftdeletion)939个,分别比野生型多113个和97个。(3)19-9-4中snps引起的非同义突变氨基酸总数82,647个,比野生型多2,039个,其中a数目最多(7,990个),色氨酸数目最少(917个);(3)19-9-4与野生型的非同义突变氨基酸中,差异量最大的是丝氨酸(206个),其次是精氨酸(203个),差异最少的是酪氨酸(6个)。(3)19-9-4的结构变异(svs)总数为405,274个,比野生型多35,934个,除了染色体异位(int)外,其他SVs类型(长片段插入LI、短段插入SI、缺失DEL及倒位INV)均比野生型多,(3)19-9-4特有的SVs总数是99,037个,多于野生型35,934个。此外,比对野生型的全基因组序列,(3)19-9-4中有106个拷贝数变异(CNVs),其中在第4号和12号染色体上CNVs均为16个,第3号染色体上只有2个。4.依据WGR分析和PCR分析验证,初步确定(3)19-9-4中外源T-DNA(GCS-IPS1-MIM168a)在Kasalath染色体上有2个可能的插入位点,其一在3号染色体2609601bp之后;其二是5号染色体的604415bp至604502bp之间。生物信息学分析表明,第一个插入位点可能涉及2个基因,其一是LOC-Os03g5334,功能预测为潜在的编码蛋白质的基因,但具体的生物学功能还未见报道;另一个是OS03G0146800(非编码RNA基因)。这两个基因是否与种子结实率调控相关,还有待进一步研究。第二个插入位点属于基因间隔区,可能不影响基因功能。总之,(3)19-9-4与野生型的全基因组重测序(WGR)比对分析结果表明,外源T-DNA导入野生型基因组后,引起了受体基因组SNPs、InDels、SV等结构和CNVs的明显差异变化,并因此导致了基因表达和氨基酸组分的变化。这些结果为深入探讨种子结实性状的分子机制提供了重要线索。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2016-05-01）
转基因沉默论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:由于氧化应激水平升高是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的可能性发病机制之一,而沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的功能与抗氧化有关,本文试图了解SIRT1是否能对抗β-淀粉样肽前体蛋白(APP)高表达的小鼠大脑或经β-淀粉样肽寡聚体(AβOs)处理的神经元中氧化应激水平的升高。方法:APP/PS1双转基因种鼠与野生型(WT)雌鼠合笼繁殖,筛选出APP/PS1双转基因小鼠,分别饲养至4月龄或8月龄时,用白藜芦醇(RSV,SIRT1激活剂)或苏拉明(SIRT1抑制剂)通过灌胃方法处理转基因小鼠,每次20 mg·kg~(-1)体重/天,时间2个月;采用原代海马神经元培养,用0.5μmol·L~(-1) AβOs处理48小时后分别用20μmol·L~(-1)RSV或300 mg·mL~(-1)苏拉明处理细胞24小时。采用CCK-8方法检测细胞存活率,筛选最佳药物处理浓度;用蛋白印记及实时定量PCR方法分别检测SIRT1蛋白和mRNA表达水平;用免疫组织化学方法检测APP高表达转基因小鼠脑组织内老年斑分布情况;用激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测原代海马神经元中活性氧(ROS)水平;用生物化学方法检测小鼠脑组织及细胞中OH~-、H_2O_2、O2_.~-水平,丙二醛(MDA)含量,以及超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果:与WT小鼠或未经处理的原代神经元相比,APP/PS1小鼠大脑或经AβOs处理的神经元中SIRT1的表达显着降低;小鼠脑组织中老年斑数量明显增加;脑组织及培养神经元中氧化应激水平明显升高,抗氧化酶水平明显降低。APP/PS1小鼠大脑或经AβOs处理的神经元中这些异常改变可通过RSV处理后减弱,而用苏拉明处理后则使其增强。结论:SIRT1可以降低APP高表达小鼠大脑及经AβOs处理的神经元中的氧化应激水平,具有神经保护作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
转基因沉默论文参考文献
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[10].曾亚.miR168a沉默转基因低结实率水稻突变体的基因组学分析[D].湖南师范大学.2016
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