（贵州省贵阳市公共卫生救治中心检验科贵州贵阳550000）
【摘要】目的：验证一套快速提取新生隐球菌DNA的方法及通用的PCR反应体系的应用。方法：使用1%SDS和0.2mol/L醋酸锂为裂解液的方法提取21株分离自环境或临床的新生隐球菌DNA，选取7个隐球菌常用基因和6个未知功能的基因设计特异性引物并进行PCR，获得的产物经电泳验证后进一步测序分析。结果：该DNA提取方法简便快速，同时提取21株新生隐球菌的DNA仅需30min，用于后续通用PCR反应体系中均能一次性扩增出目的条带，且反应稳定，特异性强，双向测序符合率在99.9%以上。结论：本文建立了一种快速高效的新生隐球菌基因提取方法，该PCR反应体系可通用于新生隐球菌各基因的扩增。
【关键词】新生隐球菌；PCR；DNA
【中图分类号】R446.61【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）36-0207-02
隐球菌（Cryptococcus）是属于担子菌门的酵母菌，为重要的临床致病真菌。随着分子生物学、基因组学等技术日益渗透到隐球菌研究领域，应用于新生隐球菌的技术方法也越来越多。其中，聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）作为一项基本的DNA扩增技术，被广泛应用于基因测序、克隆、多态性分析与疾病诊断等基础研究和临床检测的各方面。由于其应用范围广且作为实验研究的前期基础操作，因此要求扩增的方法能在尽量简便和易于标准化操作的前提下实现最大的特异性和敏感度。然而，传统的扩增方法常常需要根据每个DNA扩增片段的长度和特异引物的GC含量及Tm值反复试验，才能摸索出扩增效果最佳的条件，这样不仅费时费力，更不便于所得数据的交叉对比分析。因此，本文经过大量实验测试，应用一套优化的DNA提取和PCR扩增方法，可通用于新生隐球菌各种基因或DNA片段的扩增，获得的扩增产物特异性高，可用于大批量基因测序及后续分析研究，大量缩短了实验时间并减少了实验耗材。
1.材料和方法
1.1材料和试剂
菌株及培养基：20株分离自临床或环境的新生隐球菌，获赠自日本千叶大学医学部真菌研究所，将标准株H99设为参考菌株。YPD真菌培养基（1%酵母浸膏，1%蛋白胨，1%D-(+)-葡萄糖，2%琼脂）。
主要试剂及仪器：醋酸锂（Wako，日本），十二烷基硫酸钠（SDS，Sigma美国），2×Buffer（TOYOBO，日本），KODFXNeo（TOYOBO，日本），凝胶/PCR产物纯化试剂盒（Favorgen，台湾），BigDye测序试剂盒（ABI，美国），扩增仪（Bio-Rad，美国），电泳仪（Advance，日本），基因测序仪（ABI，美国）。
1.2方法
1.2.1菌株基因组DNA的提取按照1%SDS和0.2mol/L醋酸锂的浓度配制酵母裂解液50mL备用，将菌株接种于YPD培养基上30℃培养过夜（约16小时），取21只1.5ml离心管并编号，分别加入酵母裂解液100μL，刮取约米粒大小的隐球菌细胞团加入对应编号离心管，置于恒温加热仪中75℃孵育15min，加入90%乙醇300μL，震荡混匀，13200r/min离心1min，小心去掉上清，瞬时离心后用移液器吸走剩余液体，加入100μL超纯水，震荡混匀，13200r/min离心1min，上清中即含有浓度较高，足够用于扩增测序等后续实验分析的实验菌株的全基因组DNA，同时提取21株隐球菌DNA仅需要约30分钟。
1.2.2PCR扩增的引物设计以新生隐球菌格鲁比变种标准株H99在BroadInstitude上的基因序列为参考设计特异性的引物，扩增的基因有新生隐球菌常用基因7个（CAP59,GPD1,LAC1,PLB1,SOD1,URA5和IGS1），引物详细信息参见前研究[1]，以及未知功能基因6个（CNAG_06137，CNAG_00704，CNAG_00502，CNAG_04059，CNAG_01032，CNAG_04517）（表1）。
1.2.3PCR扩增条件在50μL的PCR反应体系中加入：菌株基因组DNA1μL，2×Buffer25μL，dNTP（2mM）5μL，前后引物各1μL，KODFXNeo1μL，ddH2O16μL。
扩增条件为：95℃预变性4min，接着95℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸1min，经过30个循环后，68℃再延伸5min。整个扩增过程约需1小时45分钟，获得的扩增产物经电泳验证，纯化后测序。
1.2.4DNA测序和序列比对DNA的测序由自动测序仪3130xlGeneticAnalyzer测定完成，并且按照制造商要求的操作流程进行，采用双向测序的方法使用PCR扩增的引物先进行测序前扩增后再上机测序，将每个基因测序所得的21个菌株的DNA片段进行处理后比对。
2.结果
取3μL扩增产物与电泳缓冲液1μL混匀，于1.0%琼脂糖凝胶电泳约20分钟，紫外灯下观察并拍照（图）。
注：1-20为分离自环境或临床的新生隐球菌；A为常用基因IGS1，长度883bp；B为未知基因CNAG_04517，长度650bp。
不同来源的21株新生隐球菌，所扩增的总共13个基因其长度在473-883bp，在同样扩增条件下均能获得清晰明亮、大小完整、无明显拖尾的产物条带。所有扩增产物均采用双向测序，所得峰图清晰完整，同一菌株、同一基因测序获得的两条互补碱基序列经比对符合率均在99.9%以上。
3.讨论
DNA模板是PCR反应复制的原始基础，模板质量的优劣，直接决定了整个PCR反应的成败。目前，文献报道了多种酵母菌DNA提取的方法[2]，由于新生隐球菌除具有普通酵母的坚韧细胞壁外，还有占其总体积70%的荚膜成分[3]，因此用玻璃珠等的机械破裂法提取隐球菌的DNA并不理想[4]。而最常用也是报道最多的是用酶消化法，市场上销售的隐球菌基因组提取试剂盒也多以酶类（如溶壁酶）作为裂解细胞的作用，价格都比较昂贵，不适合用于大批量隐球菌基因组的提取，也有研究表明RNA酶和蛋白酶K的使用与否对隐球菌的DNA扩增结果并无影响。我们在对新生隐球菌毒力相关基因的研究中对DNA提取方法经过反复实验，成功地找到了一个能快速高效提取其DNA的途径，同时提取21株新生隐球菌的全基因组DNA仅需30分钟，且获得的DNA浓度较高，在50uL的PCR反应体系中，仅需加入1uL即可成功扩增出目的基因，为此我们认为此方法不但简便、快速、高产，而且特别适合大量标本的检测及流行病学调查。
PCR是分子生物学研究中普遍应用的基本技术，但在实际操作中受反应体系和反应程序等各种因素的影响，还是常常存在扩增失败的情况。且伴随着对基因研究范围的扩大和细节的深入，不仅需要能高效的扩增出目的基因，人们对扩增特异性的要求也越来越高。本文的PCR扩增条件综合各方面因素而设定，通过对21株新生隐球菌的13个基因，共计273次PCR反应均能一次性成功，反应稳定，扩增出的目的条带清晰完整、干扰小、特异性强。将目的条带进行测序可用于新生隐球菌的菌株鉴定、分子分型、基因突变位点（包括碱基突变，插入缺失等）等分析研究。通过在后续研究中对该PCR反应体系的反复应用测试，以其他酵母菌、多细胞真菌、细菌的基因组DNA或质粒为模板，扩增片段长度在2500bp以内均能取得良好效果。若扩增片段在3000bp以上，延伸温度不变，时间延长至2分30秒可获得理想的扩增产物。
【参考文献】
[1]康颖倩,陈玉如,王梅竹等.不同毒力差异基因型的新生隐球菌MLST分型及交配型鉴定研究[J].中国真菌学杂志,2014,(05):264-267.
[2]AlessandroB,SilviaS,RobertaP,etal.RapidmethodstoextractDNAandRNAfromCryptococcusneoformans[J].FEMSYeastResearch,2001,1(3):221-224.
[3]BhattacharjeeA.K.,Kwon-ChungK.J.,GlaudermansP.OnthestructureofthecapsularpolysaccharidefromCryptococcusneoformansserotypeC[J].Immunochemistry,1978,15,673-679.
[4]郭秀军,廖万清,兰和魁等.几种快速提取新生隐球菌DNA的方法[J].中国皮肤性病学杂志,2003,17(06):410-411.