TBK1基因敲除的Marc-145细胞株的构建及PRRSV繁殖状况的初步评价

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征严重危害着世界养猪业的健康发展。每年用于防控该病的疫苗投入,更是数额巨大。目前,PRRS疫苗多采用Marc-145细胞进行生产,增殖的病毒滴度直接影响疫苗的有效性和生产成本。而Marc-145细胞存在繁殖病毒滴度低的问题。TBK1基因是宿主抗病毒天然免疫信号通路的重要枢纽,对于细胞干扰素的产生具有重要影响。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建TBK1基因敲除的Marc-145细胞株,以期提升病毒的滴度。首先,本研究针对TBK1基因多个转录本的同源区设计了2对sgRNA,以pSpCas9（BB）-2A-puro（PX459）质粒为载体,将退火形成双链的sgRNA与BbsI酶切线性化的PX459质粒相连接,成功构建了PX459+sgRNA重组质粒。使用脂质体2000转染试剂将重组质粒转染至生长状态良好的Marc-145细胞中,通过嘌呤霉素筛选,获得了多克隆细胞。再将多克隆细胞经有限稀释后,培养至96孔细胞板重,5d后每天在显微镜下观察,挑选出单克隆细胞。经一轮Touchdown PCR鉴定、二轮Touchdown PCR扩增送测序鉴定。结果共筛选出了两株TBK1基因敲除的Marc-145细胞,编号为1-3-A、2-2-18。再者,本研究选取了 3 株 HP-PRRS 毒株（JXA1-R、JXja-15、JXA1-E6）、2 株类 NADC30毒株（HNjz-15、20160802-32）、美洲型经典毒株VR2332及两株欧洲型毒株（180900-5、p073-3）,接种细胞,测定病毒滴度。结果显示:两株欧洲毒株（180900-5、p073-3）在TBK1基因敲除后的细胞上均未产生细胞病变,与正常Marc-145细胞相比,两株TBK1基因敲除后的细胞在不同程度上提升了HP-PRRS毒株、类NADC30毒株及经典VR2332毒株的繁殖效力,提升幅度在3-12倍不等。综上所述,本研究为提升PRRS病毒的增殖滴度,提供了新的思路,且获得的1-3-A和2-2-18细胞株具备用于疫苗生产的潜力。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 英文缩略表
• 第一章 文献综述
•   1 猪繁殖与呼吸综合征
•     1.1 病原学
•     1.2 培养特性
•     1.3 流行状况
•     1.4 诊断
•       1.4.1 病毒分离鉴定
•       1.4.2 分子生物学诊断方法
•     1.4.2.1 RT-PCR
•     1.4.2.2 核酸探针原位杂交检测技术
•       1.4.3 血清学诊断
•     1.4.3.1 酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）
•     1.4.3.2 间接免疫荧光抗体试验（Indirect fluorescent antibody test,IFA）
•     1.4.3.3 免疫过氧化物酶单层试验（Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）
•     1.5 猪繁殖与呼吸综合征疫苗
•       1.5.1 传统疫苗
•     1.5.1.1 灭活疫苗
•     1.5.1.2 弱毒活疫苗
•       1.5.2 新型疫苗
•     1.5.2.1 亚单位疫苗
•     1.5.2.2 DNA疫苗
•     1.5.2.3 活载体疫苗
•   2 CRISPR/Cas9基因编辑技术
•     2.1 CRISPR/Cas系统的由来
•     2.2 CRISPR/Cas系统的分类
•     2.3 CRISPR/Cas9系统
•     2.4 CRISPR/Cas9系统的应用
•       2.4.1 CRISPR/Cas9系统在细菌上的应用
•       2.4.2 CRISPR/Cas9系统在病毒上的应用
•       2.4.3 CRISPR/Cas9系统在寄生虫方面的应用
•   3 天然免疫
•     3.1 天然免疫概述
•     3.2 TBK1
•     3.3 TBK1的活化
•       3.3.1 TBK1的磷酸化修饰
•       3.3.2 TBK1泛素化修饰
•     3.4 TBK1活化的调控机制
•     3.5 TBK1的作用
•       3.5.1 TBK1与Ⅰ型干扰素的产生
•       3.5.2 TBK1的枢纽作用
• 第二章 TBK1基因敲除的Marc-145细胞株的筛选
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 材料
•       2.1.1 细胞及质粒
•       2.1.2 主要试剂耗材
•       2.1.3 主要仪器设备
•       2.1.4 试剂的配制
•     2.2 方法
•       2.2.1 获取外显子
•       2.2.2 sgRNA的设计与合成
•       2.2.3 PCR检测引物的设计与合成
•       2.2.4 重组质粒的构建
•     2.2.4.1 sgRNA的退火及双链的形成
•     2.2.4.2 质粒酶切
•     2.2.4.3 连接
•     2.2.4.4 转化与涂板
•     2.2.4.5 挑选及鉴定单克隆
•       2.2.5 Marc-145细胞的传代
•       2.2.6 细胞计数
•       2.2.7 转染
•       2.2.8 单克隆细胞的筛选
•       2.2.9 Marc-145细胞全基因组的提取
•       2.2.10 单克隆细胞的鉴定
•     2.2.10.1 第一步Touchdown PCR检测
•     2.2.10.2 第二步Touchdown PCR检测
•     2.2.10.3 测序分析
•   3 结果与分析
•     3.1 重组质粒的构建及鉴定结果
•     3.2 一轮Touchdown PCR鉴定结果
•     3.3 二轮Touchdown PCR鉴定结果
•     3.4 细胞基因测序结果
•   4 讨论
•   5 小结
• 第三章 TBK1基因敲除的Marc-145细胞株的纯净性检验、冻存及初步评价
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 材料
•       2.1.1 PRRSV毒株
•       2.1.2 引物及阳性对照
•       2.1.3 主要试剂耗材
•       2.1.4 主要仪器设备
•       2.1.5 试剂的配制
•     2.2 试验方法
•       2.2.1 病毒滴度的测定
•     2.2.1.1 病毒的繁殖
•     2.2.1.2 96孔板细胞的准备
•     2.2.1.3 病毒含量的测定
• 50结果的计算'>    2.2.1.4 TCID₅₀结果的计算
•       2.2.2 核酸提取
•       2.2.3 细胞纯净性检测
•     2.2.3.1 支原体检测
•     2.2.3.2 儿种常见病原的检测
•       2.2.4 细胞的冻存与复苏
•     2.2.4.1 细胞的冻存
•     2.2.4.2 细胞的复苏
•     2.3 统计分析
•   3 结果与分析
•     3.1 支原体检测结果
•     3.2 几种病原的检测结果
•     3.3 TBK1基因敲除细胞的初步评价结果
•   4 讨论
•   5 总结
• 参考文献
• Abstract

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘攀

导师: 田克恭

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征,病毒滴度,细胞

来源: 河南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000332

总页数: 70

文件大小: 5173K

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