线粒体靶向的比率型双光子荧光探针对细胞凋亡的可视化研究

论文摘要

细胞的大多数新陈代谢主要在线粒体上完成,线粒体参与很多过程包括:ATP产生,氧化还原场所,细胞凋亡等。细胞凋亡过程中,线粒体会受损,并影响细胞内的平衡,甚至会导致人体的神经退行性和神经肌肉等疾病。因此,监测细胞凋亡过程的进展对于疾病进展的评估是非常重要的。传统的凋亡检测方法,例如TUNEL试验和Annexin V-FITC凋亡试验,是繁琐的,不能给出实时结果。因此,非常需要实时监测细胞凋亡过程的方法。在所有开发的细胞凋亡方法中,基于荧光探针的光学测定已被广泛接受,因为它们便于精确和经济地操作,并且可以检测生物环境中的目标分析物。因此,开发双光子荧光探针检测细胞凋亡是非常好的思路。生物硫醇如Cys,Hey和GSH参与很多的生物过程。生物硫醇水平的异常会导致许多疾病的发生。并且Cys比GSH和Hcy更容易被氧化,对线粒体ROS（活性氧）的波动更敏感。因此,Cys的减少可以作为细胞凋亡的早期标记。检测早期细胞凋亡对于疾病的治疗有很好的帮助,因此,监测线粒体中的Cys水平对于生物医学研究和诊断非常重要。到目前为止,已经开发了很多方法来检测生物硫醇,例如伏安法等。这些方法提供高精度,但它们需要熟练的工人,昂贵的分析仪器和繁琐的预处理程序。在所开发的所有方法中,基于荧光探针的光学测定已被广泛接受,因为它们便于精确和经济地操作,并且可以检测生物环境中的目标分析物。极性在化学研究中是一个重要参数。并且有些有机、无机过程与周围的极性密切相关。在生物系统上,特别是在细胞系统里,极性决定了一些蛋白质和酶的相互作用并反映了一些细胞器膜的渗透性。此外,极性的异常变化可能和某些疾病息息相关。需要开发新工具检测活细胞中的极性。细胞凋亡过程中会导致线粒体极性发生变化,可以开发用于线粒体靶向定位的双光子荧光探针,用于迅速并准确地监测极性的波动,这对于细胞凋亡的探究具有非常大的意义。咔唑是一个非常好的双光子荧光团母体,因此我们课题组以咔唑为母体已经做了大量的工作。咔唑母体上可以修饰的位点比较多,这为荧光探针的设计提供了好的基础。据报道设计Cys和极性探针时,首先选择ICT机制,不仅有利于实现双通道检测分析物,而且ICT机制对极性非常敏感。因此本文中我们在咔唑的基础上合成了检测线粒体Cys和极性的探针。更重要的是,两个探针都能够实时双通道TPM可视化细胞凋亡,这对于研究细胞凋亡具有很大的意义,并且提供了一个好的思路。（1）我们分别合成了一维/二维ICT系统的一对咔唑衍生物（Mito-SCHO和Mito-DCHO）。它们都可以通过三个步骤简单地合成。正如预期的那样,具有二维ICT系统的Mito-DCHO可以特异性检测Cys,具有比率信号（119nm发射偏移）。咔唑骨架的供体（D）和Mito-DCHO中双醛基团的受体（A）构成了强大的ICT系统,这也赋予探针所需的双光子特征。此外,三苯基磷（TPP）作为线粒体定位基团。更重要的是,我们通过检测线粒体氧化应激水平,实现了对早期细胞凋亡的监测。（2）我们合成了两个化合物Mito-1和Mito-PF,其中Mito-1在检测极性的同时会受粘度的干扰,而Mito-PF特异性响应极性,不受外界环境的影响。Mito-PF的四乙炔氟作为极性的响应基团,苯并噻唑盐作为线粒体定位基团。Mito-PF可以很好地定位于线粒体中,同时具有良好的生物相容性。更重要的是,我们通过检测线粒体极性波动,实现了对细胞凋亡的监测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 概述
•   1.2 Cys荧光探针的研究进展
•     1.2.1 基于特异性检测Cys的荧光探针
•     1.2.2 检测Cys、Hcy的荧光探针
•     1.2.3 多位点检测生物硫醇的荧光探针
•     1.2.4 基于线粒体的极性荧光探针
•     1.2.5 基于溶酶体的极性荧光探针
•     1.2.6 基于细胞中其他细胞器的极性荧光探针
•   1.3 双光子荧光显微技术
•     1.3.1 双光子吸收的概念和双光子荧光探针的设计
•     1.3.2 双光子荧光显微技术
• 第二章 合理设计比率双光子荧光探针用于实时可视化细胞凋亡
•   2.1 引言
•   2.2 探针Mito-DCHO的设计
•   2.3 实验仪器及试剂
•   2.4 荧光探针的合成路线及结构表征
•     2.4.1 Mito-SCHO和Mito-DCHO的合成路线
•   2.5 实验测试部分
•     2.5.1 实验准备
•     2.5.2 双光子吸收截面的测量（δ）
•     2.5.3 细胞培养和细胞毒性测试
•     2.5.4 双光子荧光显微镜成像
•     2.5.5 LPS诱导的细胞凋亡下线粒体氧化应激水平的双色成像
•     2.5.6 LPS诱导的细胞凋亡过程中斑马鱼的比率双光子荧光成像
•   2.6 理论计算
•   2.7 结果与讨论
•     2.7.1 Mito-SCHO和Mito-DCHO与Cys/Hcy的选择性比较
•     2.7.2 Mito-SCHO对Cys的时间依赖性荧光反应
•     2.7.3 Mito-SCHO和Mito-DCHO与Cys/Hcy的时间依赖性紫外-可见光谱
•     2.7.4 化学稳定性和竞争性实验
•     2.7.5 Mito-DCHO对Cys浓度的荧光和UV-可见吸收光谱
•     2.7.6 检测限的测定
•     2.7.7 pH稳定性实验
• 1H-NMR滴定'>    2.7.8¹H-NMR滴定
•     2.7.9 Mito-DCHO,Mito-DCHO-Cys,Mito-SCHO和Mito-SCHO-Cys/Hcy的ESI-MS谱
•     2.7.10 双光子吸收特性
•     2.7.11 细胞毒性分析
•     2.7.12 Mito-DCHO靶向线粒体能力的TPM成像
•     2.7.13 Mito-DCHO对细胞中外源性和内源性Cys的双色成像
• 2O₂诱导氧化应激下线粒体Cys的双色成像'>    2.7.14 H₂O₂诱导氧化应激下线粒体Cys的双色成像
•     2.7.15 氧化应激状态下线粒体中Cys的比率荧光成像
•     2.7.16 LPS诱导的细胞凋亡过程中斑马鱼的比率TPM图像
• 第三章 用双光子比率荧光探针监测凋亡过程中线粒体极性的变化
•   3.1 引言
•   3.2 结构设计
•   3.3 实验仪器及试剂
•   3.4 荧光探针的合成路线及结构表征
•     3.4.1 Mito-I和Mito-PF的合成路线
•   3.5 实验测试部分
•     3.5.1 实验准备
•     3.5.2 双光子吸收截面的测量（δ）
•     3.5.3 细胞培养和细胞毒性测试
•     3.5.4 双光子荧光显微镜成像
•     3.5.5 光稳定性实验
•     3.5.6 共聚焦实时双通道监测细胞凋亡
•   3.6 结果与讨论
•     3.6.1 Mito-PF在不同溶剂中的荧光和UV-可见吸收光谱
•     3.6.2 探针Mito-PF在水/THF溶剂混合物中的紫外和荧光光谱
•     3.6.3 pH稳定性实验
•     3.6.4 双光子吸收特性
•     3.6.5 细胞毒性分析
•     3.6.6 Mito-PF靶向线粒体能力的TPM成像
•     3.6.7 Mito-PF在线粒体中稳定性实验
•     3.6.8 细胞凋亡下线粒体极性的双色成像
•   3.7 本章总结
• 第四章 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄银亮

导师: 冯燕

关键词: 双光子,细胞凋亡,半胱氨酸,极性,线粒体,荧光探针

来源: 安徽大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 安徽大学

分类号: Q255;O657.3

总页数: 89

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