一、氟对大鼠骨ROS和RNA含量的影响（论文文献综述）
李莉[1]（2021）在《六味地黄丸对H2O2致MC3T3-E1细胞氧化损伤的保护机制研究》文中进行了进一步梳理目的:通过建立MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤模型,观察并分析六味地黄丸含药血清对过氧化氢诱导下成骨细胞增殖、活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）及自噬的影响,探讨六味地黄丸治疗骨质疏松症的分子机制。方法:将SD大鼠分为空白对照组和六味地黄丸组。六味地黄丸组采用生药质量浓度为0.8kg/L的六味地黄丸水溶液,按照0.5ml/100g进行灌胃（每天上午、下午各灌胃一次）;空白对照组给予同体积的双蒸水灌胃。连续灌胃7天,于第7天首次给药2hrs后腹主动脉取血制备含药血清:静置2hrs,3000rpm离心10mins,分离血清,同组血清合并;56℃,灭活30mins,0.22μm滤膜过滤灭菌,分装,-20℃保存备用。常规培养MC3T3-E1细胞,取生长状态良好的P3-P4代成骨细胞,通过CCK-8试剂盒检测不同浓度H2O2对成骨细胞活力的影响,筛选适宜的H2O2损伤浓度及损伤时间,构建成骨细胞氧化损伤模型。检测不同浓度六味地黄丸含药血清对H2O2致细胞活力下降的干预作用,筛选六味地黄丸含药血清适宜干预浓度。将MC3T3-E1细胞分为5组:正常对照组、H2O2模型组、空白对照组、六味地黄丸组、H2O2+乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine,NAC:ROS抑制剂）组,H2DCFDA试剂盒检测细胞内ROS水平,分析六味地黄丸含药血清对H2O2致MC3T3-E1细胞ROS水平改变的影响。将MC3T3-E1细胞分为6组:正常对照组、H2O2模型组、空白对照组、六味地黄丸组、H2O2+NAC组、六味地黄丸+3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA:自噬抑制剂）组,Western blot检测各组细胞Runx 2、Beclin 1蛋白表达;q RT-PCR检测各组细胞Runx 2、Beclin 1、LC3B m RNA表达。结果:1.过氧化氢对MC3T3-E1细胞活力的影响及六味地黄丸含药血清的干预作用低浓度（0.05mmol/L）的H2O2对MC3T3-E1成骨细胞活力的抑制作用并不明显（P>0.05）,而随着H2O2浓度及作用时间的增加,细胞活力逐渐减弱。0.1mmol/L的H2O2在作用MC3T3-E1细胞24hrs后可明显抑制细胞活力（P<0.05）,接近正常对照组的60%-70%,提示MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤模型建立成功。故选择0.1mmol/L浓度的H2O2氧化损伤成骨细胞24hrs作为后续实验的展开条件。加入不同浓度六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1成骨细胞进行保护干预后加入H2O2氧化损伤24hrs。发现相同作用时间下（24hrs）,随着六味地黄丸含药血清浓度的升高,MC3T3-E1成骨细胞活力逐渐增加,呈现一定的剂量依赖趋势。20%浓度六味地黄丸含药血清保护干预后,细胞活力为113%,与H2O2模型组相比,细胞活力明显升高（P<0.05）。5%、10%浓度的六味地黄丸含药血清保护干预下,细胞活力分别为79%、106%;而30%浓度的六味地黄丸含药血清对细胞活力具有显着抑制作用。提示20%浓度的六味地黄丸含药血清可促进H2O2作用下的MC3T3-E1细胞增殖。选择20%浓度的六味地黄丸含药血清保护干预MC3T3-E1成骨细胞24hrs为后续实验的展开条件。2.六味地黄丸含药血清对过氧化氢致MC3T3-E1细胞ROS水平改变的影响与正常对照组相比,H2O2模型组细胞ROS水平显着升高（P<0.05）;与H2O2模型组相比,六味地黄丸组细胞ROS水平明显减低（P<0.05）,与加入NAC组的细胞ROS水平比较无明显差异（P>0.05）。虽空白对照组的细胞ROS水平虽也呈降低趋势,但仍高于正常对照组和六味地黄丸组,且其与H2O2模型组相比无显着统计学差异。提示六味地黄丸含药血清可部分降低H2O2作用下MC3T3-E1成骨细胞的ROS水平。3.六味地黄丸含药血清对过氧化氢诱导MC3T3-E1细胞Runx 2、Beclin 1、LC3B表达的影响加入六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1成骨细胞进行保护干预24hrs后加入H2O2氧化损伤24hrs。与正常对照组、H2O2模型组相比,六味地黄丸组细胞的Beclin 1蛋白表达升高（P<0.05）,而3-MA可抑制该作用;空白对照组细胞的Beclin 1蛋白表达也有增加趋势,但仍低于六味地黄丸组,且与其他组别相比较无显着统计学差异（P>0.05）。与正常对照组、H2O2模型组、H2O2+NAC组及空白对照组相比,六味地黄丸组细胞自噬相关Beclin 1、LC3B m RNA表达显着升高（P<0.05）,而3-MA可明显抑制六味地黄丸的这种作用。除六味地黄丸+3-MA组、空白对照组的Runx 2 m RNA表达低于正常对照组（P<0.05）,余各组间的Runx 2蛋白和m RNA表达无显着性差异。提示H2O2氧化损伤作用下,MC3T3-E1细胞自噬相关Beclin 1、LC3B m RNA表达降低;而六味地黄丸含药血清可提高H2O2作用下的成骨细胞Beclin 1、LC3B m RNA表达。结论:H2O2能够抑制MC3T3-E1细胞活性,使细胞内ROS水平升高,自噬相关Beclin 1、LC3B m RNA表达降低;而六味地黄丸含药血清可促进H2O2作用下的细胞增殖,降低细胞内ROS水平,提高Beclin 1、LC3B m RNA的表达。说明六味地黄丸可通过诱导自噬来减轻氧化应激状态下的MC3T3-E1成骨细胞损伤。
曾纪焕[2]（2021）在《晚期氧化蛋白产物影响骨细胞硬骨素表达参与增龄性骨量丢失的作用与机制》文中认为研究背景晚期氧化蛋白产物（Advanced Oxidation Protein Products,AOPPs）是蛋白质在氧化应激（Oxidative Stress,OS）状态下形成的一类富含双酪氨酸的蛋白交联物。它们不仅是OS的后果,也是一类重要的致病介质,参与多种疾病的发生、发展。AOPPs与骨质疏松关系密切。随着年龄的增加,人体内AOPPs蓄积。前期研究证实:AOPPs干预的老年大鼠骨量丢失、骨质退化速度加快,但其机制不清楚。硬骨素（sclerostin）是一种主要由骨细胞分泌的糖蛋白,能特异性阻断Wnt/β-catenin通路,对成骨细胞、破骨细胞均能产生明显影响,其在抑制骨形成的同时促进骨吸收,具有显着的负性骨调节作用。我们的前期研究显示,AOPPs干预的老年大鼠成骨活性降低,破骨活性升高,这提示AOPPs的促骨丢失效应可能与sclerostin的作用有关。此外,人体内血浆sclerostin浓度随年龄增加而升高。因此,本研究进一步假设:AOPPs可能通过影响骨细胞sclerostin表达参与增龄性骨量丢失。材料方法先行AOPPs干预实验,12月龄雄性C57BL/6小鼠,分别给予PBS、50mg/kg.d的血清白蛋白（BSA）、50mg/kg.d及100mg/kg.d的AOPPs-BSA进行干预,持续干预16周,分析AOPPs对老年小鼠骨密度、骨微结构、骨代谢水平,骨组织内sclerostin、Sirt1表达及氧化应激水平的影响;再以骨细胞系MLO-Y4细胞为模型,观察AOPPs对骨细胞sclerostin表达的影响并研究其机制;最后进行药物阻断实验,老年小鼠在给予100mg/kg.d的AOPPs-BSA干预的同时,分别给予100 mg/kg/d 的 apocynin（NADPH 氧化酶抑制剂）,100mg/kg/d 的 NAC（ROS 清除剂）及50mg/kg.d的SRT3025（Sirt1激动剂）进行共刺激,观察各组小鼠骨密度、骨微结构及sclerostin表达的差异。结果50mg/kg.d的AOPPs-BSA可显着降低老年小鼠L4椎体骨密度,当干预剂量提高至100mg/kg.d时,这一作用更显着;AOPPs对小鼠胫骨骨密度无明显影响。AOPPs干预的老年小鼠L4椎体及胫骨近端BV/TV、Tb.Th、Tb.N明显降低,而Tb.Sp明显升高;AOPPs干预组小鼠血清I型前胶原氨基端前肽水平降低,而I型胶原羧基端交联肽水平升高;相应的,其胫骨内层骨膜周围单位骨面积内成骨细胞数目减少而破骨细胞面积增加。AOPPs也明显提高胫骨骨组织内sostmRNA及sclerostin蛋白水平,而AOPPs干预的小鼠骨组织内Sirt1 mRNA及Sirt1蛋白水平降低。AOPPs干预组小鼠血浆AOPPs浓度及骨组织内丙二醛浓度升高,而总超氧化物歧化酶活性降低。体外实验表明,AOPPs可提高MLO-Y4细胞sclerostin蛋白表达;AOPPs通过激活NADPH氧化酶,产生大量ROS,造成细胞内OS,使Sirt1蛋白表达减少,从而提高MLO-Y4细胞sclerostin蛋白表达水平。体内阻断实验显示,相对于AOPPs单独干预组,联合应用apocynin、NAC、SRT3025干预组小鼠胫骨骨组织内sost mRNA及sclerostin蛋白水平均下调,L4椎体骨密度升高,L4椎体及胫骨近端骨小梁微观结构退化程度得到改善。结论AOPPs通过NADPH氧化酶依赖的ROS生成,造成细胞内OS,使骨细胞内Sirt1合成减少,从而上调sclerostin蛋白表达,抑制骨形成而促进骨吸收,诱导增龄性骨量丢失。
冉龙艳[3]（2021）在《NRH：醌氧化还原酶2介导慢性氟中毒大鼠脑组织氧化应激损伤及自噬功能改变的机制研究》文中提出目的:长期摄入过量的氟能够通过血脑屏障沉积在脑组织中,引起中枢神经病理学改变和认知功能障碍,导致慢性氟中毒性脑损伤。其海马区功能和分子水平的变化机制研究,是目前慢性氟中毒脑损伤的研究重点。氧化应激学说对慢性氟中毒引起的机体多系统病理改变能给出较全面的和相对合理的解释,是慢性氟中毒脑损伤机制中较重要的支撑性理论,但仍需继续丰富和进一步证实。近年来,已发现慢性氟中毒导致的中枢神经系统损伤与自噬水平改变有关,且自噬在氧化应激产生的细胞信号传导改变和细胞损伤过程中起到关键作用。NRH:醌氧化还原酶2（NRH:quinone oxidoreductase 2,NQO2）具有高活性分子特征,能够导致活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生,加重氧化应激损伤,也能造成自噬异常改变。但是,在慢性氟中毒脑损伤机制中,氧化应激水平升高和自噬改变之间是否有相关关系、两者之间是否有关键因子相连接等仍不清楚。本课题主要研究慢性氟中毒导致的大鼠脑组织海马区域氧化应激和自噬功能的改变,并研究氧化应激和自噬改变之间是否通过NQO2相连接,来探讨慢性氟中毒脑损伤的发生机制。方法:1、慢性氟中毒大鼠研究:（1）动物模型复制:采用不同含氟浓度饮水（5 ppm,50 ppm和100 ppm）分别饲喂Sprague-Dawley（SD）大鼠3个月和6个月,复制慢性氟中毒动物模型。实验结束时观察大鼠氟斑牙形成,测定大鼠血液、尿液、骨组织和脑组织中含氟量,用以评价模型复制情况。（2）动物行为学研究:使用Morris水迷宫开展定向巡航实验和空间探索实验以评价长期摄入氟对实验动物学习和记忆能力的影响。（3）脑组织病理学观察:用苏木精-伊红染色法检查大鼠脑组织一般组织形态改变;用神经元尼氏染色法观察动物大脑海马区域神经元尼氏小体的变化。（4）海马组织氧化应激水平检测:使用流式细胞仪和生化方法检测大鼠脑组织ROS和脂质过氧化物代谢产物丙二醛（Malonydialdehyde,MDA）含量及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性。（5）海马组织自噬水平检测:使用透射电子显微镜观察大鼠脑组织海马区域神经元亚显微结构变化以及自噬体数量;蛋白印迹法检测自噬相关蛋白,包括:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mechanistic target of rapamycin,m TOR）,自噬相关蛋白5（Autophagy related5,ATG5）,微管结合蛋白1A/1B轻链3B（Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3Ⅱ）和自噬接头蛋白p62（p62/sequestosome-1,p62/SQSTM1）的表达变化;荧光免疫组化检测大鼠海马区域自噬相关蛋白m TOR、ATG5和p62的表达。（6）实验动物海马组织转录组和蛋白组测序以及生物信息学分析:采用高通量RNA测序（RNA-seq）和串联质谱标签（Tandem-Mass-Tag,TMT）蛋白组学技术对大鼠海马组织进行测序;通过差异分析和聚类分析评价高氟处理对于大脑海马组织基因和蛋白层面的影响;使用相关性分析和交集分析获取在基因和蛋白层面协同变化的分子,并挑选与氧化应激和自噬有关的分子——NQO2进行后续研究;转录组和蛋白组测序数据采用实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）和平行反应检测（Parallel reaction monitoring,PRM）靶向蛋白组学技术进行验证。（7）NQO2表达与自噬及氧化应激相关性:蛋白印迹法检测动物脑组织NQO2的蛋白表达,并与自噬相关蛋白和氧化应激指标进行皮尔森相关性分析。2、体外培养SH-SY5Y（人神经母细胞瘤）细胞NQO2改变相关性机制研究:（1）RNA干扰和小分子药物处理干扰NQO2表达:构建靶向NQO2的干扰慢病毒转染SH-SY5Y细胞,并使用NQO2抑制剂S29434及激活剂Menadione来调控氟处理的SH-SY5Y细胞模型中NQO2的表达;（2）分析靶向调控氟处理的SH-SY5Y细胞模型中NQO2的表达后自噬和氧化应激改变:检测NQO2抑制或活化状态下,氟处理对自噬水平和氧化应激水平的影响。结果:1、慢性氟中毒大鼠模型复制成功:染氟组大鼠出现不同程度的氟斑牙,血液、尿液、骨组织和脑组织中氟含量均明显高于对照组,且与染氟剂量成正相关关系。2、慢性氟中毒大鼠学习记忆能力降低:染氟组大鼠逃避潜伏期明显高于对照组;普遍出现穿台次数减少和在目标象限停留时间减少的现象。3、慢性氟中毒大鼠脑组织神经元病理改变:HE染色显示,经氟处理后大鼠脑组织海马CA3区未见明显形态学变化;尼氏染色结果显示染氟组大鼠脑组织海马CA3区神经元尼氏小体较对照组数量明显减少,染色变浅。4、染氟组大鼠脑组织氧化应激水平增高:慢性氟中毒大鼠大脑海马组织MDA和ROS含量明显升高,SOD活性明显降低。5、透射电镜观察结果:染氟组大鼠海马CA3区神经元细胞出现核型不规则,核膜皱缩、凹陷呈锯齿状、染色质聚集;胞浆内自噬体明显增多,但未见自噬体数量随染氟时间延长而增多的情况。6、慢性氟中毒大鼠海马组织LC3II及p62蛋白水平表达改变:p-m TOR表达降低,ATG5、LC3 II和p62表达升高,提示自噬流阻滞,自噬水平异常。7、转录组学和蛋白组学测序结果:与对照组相比,差异表达基因主要富集在认知功能,学习记忆能力,长时程增效以及自噬调控信号通路中。联合转录组学和蛋白组学分析发现13个变化趋势一致的差异基因,其中NQO2表达差异性最高。8、慢性氟中毒大鼠脑组织NQO2蛋白表达水平改变:蛋白印迹和免疫荧光组织化学结果均显示NQO2在慢性氟中毒大鼠海马组织中呈现高表达状态,与染氟剂量呈正相关关系;NQO2表达量与自噬相关蛋白的变化以及氧化应激指标呈显着相关性。9、体外培养细胞NQO2调节机制研究结果:氟处理后,SH-SY5Y细胞NQO2表达升高,p-m TOR表达降低,ATG5、LC3 II和p62表达升高,提示自噬流阻滞,自噬水平异常;细胞MDA和ROS含量明显升高,SOD活性降低,提示氧化应激水平升高。采用慢病毒干扰和小分子化合物特异性处理调控NQO2表达,结果提示抑制NQO2表达能够降低p62表达,恢复自噬流水平,降低氧化应激影响。结论:1、慢性氟中毒大鼠学习记忆能力降低可能与海马区氧化应激水平升高、自噬功能异常有关:染氟大鼠脑组织ROS及MDA含量增多,SOD活性降低;自噬启动相关蛋白p-m TOR表达降低,自噬体形成相关蛋白ATG5和LC3 II表达增加,自噬溶酶体功能相关蛋白p62积累。2、慢性氟中毒大鼠智力损伤与海马区基因及蛋白水平改变密切相关:差异基因主要出现在富集于与学习、记忆能力和大脑奖赏机制相关的信号通路;部分与认知相关的基因改变持续存在,无法逆转。3、慢性氟中毒大鼠海马组织NQO2增加,可能促进氧化应激水平增加及自噬功能异常:NQO2升高与染氟剂量有关,且与自噬功能异常和氧化应激水平显着相关。4、氟可以促进自噬启动,在一定程度是一种代偿性保护机制;但是随着损伤积累,自噬流不畅,自噬清除功能受阻。而抑制NQO2能够降低氧化应激水平、恢复自噬流通畅,提示NQO2可能是调控自噬流的关键因子。
唐乐[4]（2021）在《不同钙水平下氟暴露致肾脏损伤作用及机制》文中提出氟（Fluorine,F）是人体内必不可少的微量元素,适量摄入有益于骨骼发育,一旦被过量摄入就会引发全身性病变,称为地方性氟中毒。氟暴露不只能导致牙齿和骨骼受损,还能对脑、心血管、肾脏等器官造成严重危害。肾脏是氟暴露的主要靶器官,氟摄入过多会改变肾脏的组织病理学和代谢功能。近年来,氟致肾脏损伤的分子机制已引起广泛关注。研究表明,氟能诱导肾脏G0/G1阻滞、自由基代谢紊乱引起细胞膜受损,从而通过多种信号通路诱导细胞异常凋亡。Ca2+是细胞内“第二信使”,参与细胞分化、细胞凋亡等过程。并有文献表明,钙的补充可以拮抗机体对氟的吸收及其毒性,降低细胞凋亡率,但迄今不同钙水平下氟暴露致肾脏损伤作用及机制仍未见报道。本实验选用初断乳ICR雄性小鼠120只,适应饲养环境7天后分为6组,染氟3个月和6个月后,观察小鼠肾脏组织形态结构和细胞凋亡率;用Fluo-4和DCFH-DA荧光探针负载分别检测小鼠肾脏细胞内Ca2+水平和ROS水平;用RT-PCR、Western Blot方法检测小鼠肾脏细胞膜L型钙通道Cav1.2、细胞内死亡受体信号转导通路分子TNF-α、TNFR1、TRADD和下游凋亡调节因子Caspase-8、Caspase-3基因/蛋白表达水平,拟首次系统探讨不同钙水平下死亡受体途径在氟暴露致肾脏损伤作用及机制,同时,筛选安全剂量的抗氟剂,为预防氟中毒提供基础资料。研究结果如下:（1）小鼠体重、肾脏重量及肾脏脏器系数测定结果:各组小鼠体重,脏器系数分别与亚慢性和慢性氟暴露C组和F组比,均无显着性变化（P>0.05）。（2）小鼠肾脏损伤相关血液指标测定结果:各处理组小鼠BUN、Cr、UA含量较对照组显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）。与F组比,LCa+F组小鼠BUN、Cr、UA含量显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,而HCa+F组BUN、Cr含量显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组和LCa+F组小鼠肾脏组织BUN含量显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,LCa+F组小鼠Cr含量显着升高（P<0.05）,F和LCa+F组UA含量极显着升高（P<0.01）。（3）小鼠肾脏组织形态结构观察C组肾小球结构清晰,肾小管上皮细胞正常。而F组肾小球整体缩小,肾上皮细胞肿胀或空泡样变。与F组比,LCa+F组肾小囊腔变大,空泡样变增多,而HCa+F组肾上皮细胞形态结构完整,排列规则有序,空泡样变减少。（4）小鼠肾脏细胞凋亡检测统计结果:与C组比,各处理组小鼠肾脏细胞凋亡数量极显着上升（P<0.01）。与F组比,LCa+F组小鼠肾脏细胞凋亡数量极显着上升（P<0.01）;而HCa+F组小鼠肾脏细胞凋亡数量极显着减少（P<0.01）。与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F和LCa+F组小鼠肾脏细胞凋亡数量极显着上升（P<0.01）。（5）小鼠肾脏细胞内Ca2+水平检测统计结果:与C组比,各处理组Ca2+水平均显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）。与F组比,LCa+F组Ca2+水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,而HCa+F组Ca2+水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组,LCa+F组和HCa+F组Ca2+水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）。（6）小鼠肾脏细胞内活性氧水平检测统计结果:与C组比,各处理组ROS水平均显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）。与F组比,LCa+F组小鼠肾脏细胞内ROS水平极显着升高（P<0.01）,而HCa+F组ROS水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F和LCa+F组ROS水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）。（7）基因/蛋白检测统计结果:与C组比,各处理组Cav1.2、TNF-α、TNFR1、TRADD、Caspase-8、Caspase-3基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）。与F组比,亚慢性和慢性氟暴露LCa+F组小鼠Cav1.2、TNF-α、TNFR1、TRADD、Caspase-8、Caspase-3基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,而亚慢性和慢性氟暴露HCa+F组Cav1.2、TNF-α、TNFR1、Caspase-3基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）,亚慢性氟暴露HCa+F组TRADD蛋白表达水平极显着降低（P<0.01）,慢性氟暴露HCa+F组TRADD基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）,亚慢性氟暴露HCa+F组Caspase-8基因表达水平显着降低（P<0.05）,慢性氟暴露HCa+F组Caspase-8基因/蛋白表达水平极显着降低（P<0.01）。与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组和LCa+F组小鼠TNF-α、TNFR1、Caspase-3基因/蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,F组、LCa+F组和HCa+F组小鼠Cav1.2、TRADD基因/蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,F组和HCa+F组小鼠Caspase-8基因/蛋白表达水平显着增高（P<0.05）。综上所述,氟暴露致肾脏损伤的分子机制可能是:氟暴露致小鼠肾脏细胞膜L-型钙离子通道Cav1.2基因/蛋白表达水平上升,导致细胞内钙超载,并引起ROS表达水平升高,使肾脏组织抗氧化能力下降;同时过多的ROS活化肾脏细胞膜上的死亡受体TNF-α,激活TNF-α/TNFR1信号通路,并使小鼠肾脏死亡受体信号转导通路分子TNF-α、TNFR1、TRADD基因/蛋白表达水平显着升高,上调下游凋亡信号分子Caspase-8、Caspase-3基因/蛋白表达水平,诱导肾脏细胞凋亡异常,最终导致肾脏细胞受损。而膳食高钙（2%）能够显着地逆转上述氟暴露致肾脏细胞膜L-型钙离子通道Cav1.2基因/蛋白表达水平和抑制细胞内钙超载,并拮抗氟暴露引起死亡受体通路凋亡分子的异常表达,最终降低细胞凋亡率,从而改善氟暴露致雄性小鼠肾脏损伤。结果提示,死亡受体途径参与了氟致细胞凋亡异常,在氟暴露致肾脏损伤过程中起重要作用,且膳食高钙（2%）可能是一种经济、有效的抗氟剂。
周维政[5]（2021）在《氟化物对发育性髋关节发育不良发病易感性的影响及其作用机制的研究》文中研究说明目的:发育性髋关节发育不良（DDH）是一种较为常见的儿童髋关节出生缺陷疾病,早期会影响学步期儿童的步态,晚期可进展为骨关节炎,严重降低儿童生活质量。早发现,早预防能够显着改善DDH的治疗结局。但DDH病因尚不清楚,目前已普遍接受其是由遗传与环境等多因素共同作用所导致。除易感基因外,已知的危险因素还包括关节松弛、宫内臀位以及生后直腿襁褓等。尤其是关节松弛作为主要危险因素,其增加会明显提高DDH的发病易感性。尽管目前DDH与微量元素的摄入水平之间的相关性尚缺乏有力的证据,但是越来越多的研究提示氟化物亦会对软组织,尤其是富含胶原蛋白的软组织造成损害。而关节囊是维持髋关节结构强度与稳定性的重要解剖结构,其成分便是胶原蛋白。然而以往研究中并无氟化物致DDH发病的相关报道,因此本研究构建氟中毒与DDH联合的动物模型,以明确氟化物的过量摄入能否造成髋关节关节囊结构强度下降,进而导致关节松弛,增加DDH的发病易感性,并进一步探究其内在的分子生物学机制。研究方法:本研究共分为三部分。第一部分、生命早期高氟暴露对DDH发病率的影响将12只3月龄的Wistar孕鼠（孕0天）随机分成对照组、饮氟50 mg/L组、饮氟100 mg/L组和饮氟150 mg/L组共4组。孕鼠分娩后仍采用相同浓度喂养直至幼鼠离乳（生后21天）。生后立即对幼鼠后肢直腿襁褓体位固定4天。观察各组DDH的发生率。第二部分、氟化物对正常大鼠髋关节关节囊形态结构及功能的影响及其作用机制将9只3月龄的Wistar孕鼠（孕0天）随机分成3组,即对照组,饮氟50 mg/L组和饮氟100 mg/L组。孕鼠分娩后仍采用相同浓度喂养直至幼鼠离乳（生后21天）。收集各组子代髋关节关节囊,利用扫描电子显微镜观察关节囊随着氟化物浓度的升高其表面胶原纤维束排列变化趋势;利用透射电子显微镜观察关节囊随着氟化物浓度的升高其胶原纤维直径变化趋势;通过Masson染色观察各组关节囊形态以及胶原纤维含量变化;PCR以及Western Blot检测分析各组关节囊组织中Col1a1与Col3a1的mRNA水平以及蛋白质表达水平差异;利用凋亡检测试剂盒与Western Blot检测各组关节囊组织凋亡水平以及凋亡相关蛋白质表达水平的变化。第三部分、氟化物对大鼠关节囊原代成纤维细胞的胶原代谢的影响及其作用机制利用组织块法从正常组大鼠髋关节关节囊中提取原代成纤维细胞并对其进行鉴定;利用CCK-8法观察含不同浓度氟化物的培养基对原代成纤维细胞的毒性作用,确定实验组细胞接受氟化物干预的浓度;利用细胞免疫荧光观察实验组与对照组Col1a1与Col3a1在细胞水平的表达;利用透射电子显微镜观察元代成纤维细胞内亚细胞结构改变;PCR以及Western Blot检测原代成纤维细胞凋亡相关蛋白表达变化趋势;利用流式细胞分析技术分析实验组与对照组发生细胞凋亡的比例;通过检测原代成纤维细胞线粒体膜电位（MMP）、活性氧自由基（ROS）、过氧化氢酶活力（CAT）、超氧化物歧化酶活力（SOD）、总抗氧化能力（AOC）以及氧化应激损伤指标丙二醛（MDA）的含量综合分析对照组和实验组之间氧化应激产生及损伤严重情况差异。结果:第一部分、生命早期高氟暴露对DDH发病率的影响1、生命早期高氟暴露联合生后直腿襁褓建立慢性氟中毒DDH模型成功;2、高氟暴露显着增加生后直腿襁褓所致的DDH的发病率。第二部分、氟化物对正常大鼠髋关节关节囊形态结构及功能的影响及其作用机制1、未施加直腿襁褓方式而单纯生命早期高氟暴露不会导致DDH发病;2、染氟组髋关节关节囊较对照组菲薄,胶原纤维直径纤细,纤维束排列疏松紊乱;3、染氟组关节囊Col1a1与Col3a1的mRNA水平较对照组显着下调,而蛋白表达水平Col1a1呈下降趋势,与Col3a1变化趋势相反;4、染氟组关节囊细胞凋亡发生较对照组明显增多,凋亡相关蛋白表达水平同样较对照组明显升高。第三部分、氟化物对大鼠关节囊原代成纤维细胞的胶原代谢的影响及其作用机制1、Col1a1与Col3a1在原代成纤维细胞经氟化物染毒处理后表达趋势与体内实验结果一致;2、在原代成纤维细胞中染氟组凋亡相关基因的mRNA水平以及蛋白表达水平均显着上调;3、染氟组原代成纤维细胞内超微结构（线粒体、内质网等）较对照组发生明显变化;4、经染氟处理后的原代成纤维细胞其线粒体膜电位水平显着下降,活性氧自由基产生明显增加,过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力以及总抗氧化能力无明显改变,而氧化应激损伤水平MDA含量较对照组升高;5、原代成纤维细胞中染氟组发生早期凋亡与晚期凋亡的细胞比例显着高于对照组。结论:1、生命早期高氟暴露并不会直接导致DDH的发病;但会增加DDH的发病易感性;2、高氟造成关节囊胶原纤维纤细且排列稀疏紊乱,导致机械强度下降引发关节松弛;3、高氟下调关节囊Col1a1的表达,但上调Col3a1的表达;4、高氟激活关节囊成纤维细胞的氧化应激,调控线粒体内源性途径,促使关节囊成纤维发生细胞凋亡。
刘迪[6]（2020）在《蕨麻黄酮对镉氧化毒性介导骨质疏松症的干预作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理近年来,氧化应激作为骨质疏松（osteoporosis,OP）的一个危险因素已受到高度重视。重金属镉（Cadmium,Cd）,因其毒性可致细胞内离子稳态失衡、抗氧化系统损伤、线粒体受损,从而导致ROS增加。ROS的增加,可导致氧化应激效应,激活FoxO通路和抑制Wnt通路,导致骨密度（bone mineral density,BMD）下降、骨质流失等骨质疏松症状。氧化应激诱发OP的主要机制有两个方面,一是离子稳态失衡、线粒体膜受损、线粒体依赖性通路激活,引起细胞凋亡;二是抑制骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）表达,激活核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL）表达,活化破骨细胞,促进骨吸收。因此,应用具有抗氧化活性的物质可能是防治OP的新靶点。黄酮类化合物大多具有酚羟基结构,可与金属离子生成稳定的螯合物,阻止金属离子催化生成氧自由基,终止脂质过氧化反应;还可作为自由基的受体阻碍自由基连锁反应,从而起到抗氧化作用;有人报道,蕨麻黄酮类化合物（PAF）对食用油脂有较强的抗脂质过氧化作用和抑制自由基产生,抗自由基能力优于维生素C和柠檬酸。由此,可推测PAF可能抑制Cd染毒引起的ROS过度蓄积,拮抗氧化应激,从而抑制FoxO信号通路因子、激活Wnt通路,发挥抗OP作用。目的:基于上述结果,本研究以ROS增加是OP发病的起因为主题,以氧化应激致OP发病的机制为主导,模拟骨细胞氧化应激和动物氧化应激性OP,建立Cd染毒细胞及OP动物模型。在梯度浓度PAF和NAC干预下,通过抗氧化、抗凋亡、相关蛋白表达、骨质及其生物力学等实验研究,探讨PAF抗OP活性及其机制。为进一步认识OP发病机制、Cd骨氧化毒性以及OP防治提供实验依据,也为蕨麻的开发利用提供思路。方法:1.微波辅助乙醇提取法提取青海玉树秋季蕨麻的PAF。2.Cd梯度浓度染毒MC3T3-E1细胞、BALB/c雄性小鼠,建立Cd细胞毒性和OP动物模型,主要以BMD、骨组织形态计量学、骨生物力学的变化作为OP模型成功的评价指标,确定Cd造模剂量。3.体外抗氧化实验和MC3T3-E1细胞培养检测PAF抗氧化能力。4.显微和超微观察、比色法、CCK-8和流式细胞术、生化法、ELISA法、Western Blot、qRT-PCR等方法,观察和检测ROS、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力和丙二醛（MDA）含量及磷酸化p66shc蛋白表达;血清碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白（Bone Gla Protein,BGP）、OPG、RANKL及人抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP5b）水平;细胞生存率和凋亡率、细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)、线粒体膜电位（MMP）、凋亡相关蛋白;成骨及成脂分化调控因子以及FoxO3a与Wnt信号通路中相关基因与蛋白的表达水平。5.检测BMD、骨组织形态计量学、骨生物力学变化;HE染色及透射电镜观察骨组织结构变化。结果:1.微波辅助乙醇提取法提取青海玉树秋季蕨麻的PAF。最佳条件为:乙醇浓度50%、料液比1:25、微波时间20 min、微波温度70℃。提取量:14.63±0.21mg/g。2.在体外,PAF在3.125 mg/L浓度即有抗氧化活性,而细胞内25 mg/L效果明显,并有明显的量-效关系。3.Cd梯度浓度染毒MC3T3-E1细胞,其终浓度达到30μM,ROS含量最高,Cd梯度浓度染毒BALB/c雄性小鼠,浓度达2 mg/kg出现BMD、骨组织形态计量学、骨生物力学的变化。4.PAF干预,可使Cd染毒细胞和骨质疏松动物模型GSH-Px、SOD和CAT升高,ROS、MDA含量及磷酸化p66shc蛋白表达降低;[Ca2+]i浓度明显下降、MMP恢复,Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及ATPase活性增加,Bcl-2表达增加、Bax表达降低,Bcl-2/Bax比值升高、细胞色素C（Cytochrome C,Cyt C）、凋亡诱导因子（Apoptosis-inducing factor,AIF）、Cleaved caspase-3蛋白的表达下降,细胞生存率增高、凋亡率下降;血清ALP、BGP、OPG及OPG/RANKL升高;而RANKL和TRACP5b表达降低;提高成骨分化、降低成脂分化相关调控因子表达;降低FoxO3a蛋白及Gadd45α基因的表达,同时提高Wnt信号通路中β-catenin蛋白及靶基因Axin2的表达。5.PAF干预,股骨BMD明显升高,骨小梁厚度、骨小梁体积分数显着增加,骨小梁间距变小;最大载荷和弹性模量显着升高;改善骨组织超微结构的损伤。结论:1.初次用微波辅助乙醇提取法提取青海玉树秋季蕨麻PAF,最佳条件下提取量为14.63±0.21 mg/g。2.初次利用Cd氧化毒性建立OP动物模型。Cd致毒剂量,细胞:CdCl2 30μM;小鼠:CdCl2 2 mg/kg,可分别用于建立细胞毒性和OP动物模型。3.PAF无毒性,有效抗氧化剂量,细胞6.2525 mg/L;小鼠1.5 mg/kg。4.Cd的骨毒性源于氧化应激反应、[Ca2+]i稳态失衡、细胞凋亡、激活RANKL/RANK/OPG信号通路,促进骨吸收,导致OP。PAF有较好的抗氧化、稳定离子平衡、保护骨细胞活性、抑制骨吸收,调节骨吸收与骨形成平衡,实现抗OP的作用。5.Cd毒性诱导凋亡的途径是线粒体依赖性凋亡通路。PAF通过保护线粒体膜、稳定ATP酶活性、升高Bcl-2/Bax比值,下调CytC、AIF、Cleaved caspase-3蛋白表达调节线粒体依赖性凋亡通路。6.Cd骨毒性通过抑制负责成骨分化的Wnt/β-catenin信号通路,激活FoxO3a转录因子及靶基因,诱导产生氧化应激,抑制骨形成,从而促进OP发生。PAF能够通过调控FoxO3a/Wnt信号通路发挥抗OP的作用。
蒋宁宁[7]（2020）在《氟对骨细胞调控成骨作用的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:氟元素对人体健康不可或缺,但摄入过量的氟可引起人体生理及病理的变化,从而对身体造成损害。地方性氟中毒是我国流行最为广泛、病情最为严重的地方病之一。氟主要侵犯骨组织,氟斑牙和氟骨症是地方性氟中毒的特征性损害。成年人体内99%的氟化物都存在于钙化组织（主要是骨骼）中,过量氟暴露引起的氟骨症与代谢性骨转换密切相关。研究者已经证明了氟骨症病变在不同条件下也会有活跃进展时期或相对静止时期;就其进展时期而言,无疑是处于高骨转换状态骨代谢的主要形式或骨重建循环,即破骨细胞通过分泌酸性物质溶解旧骨,从而发挥骨吸收功能;成骨细胞通过分泌、合成以及矿化骨基质来形成新骨,从而发挥骨形成功能。大量研究表明骨细胞直接参与骨形成和骨重建过程,其通过影响破骨细胞和成骨细胞的分化成熟来影响骨重建过程。近年来,有关氟骨症的基础研究热点多在于氟化物对成骨、破骨的调控机制上,对骨细胞的研究相对较少,而氟化物对骨细胞如何调控成骨作用的研究更是少见。甲状旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH）是由甲状旁腺细胞所分泌的能够调控机体内钙稳态的一种活性多肽类激素。大量研究证实,PTH能够通过影响成骨细胞和骨细胞来参与骨转换过程。因此本实验利用骨组织的三种主要类型细胞进行染氟实验研究,旨在探究氟化物在骨细胞调控成骨机制中的作用,并进一步分析PTH在其中的地位,从而为进一步深入研究氟骨症的发病机制提供理论基础。实验方法:1.单独培养的骨组织细胞染氟实验研究:我们选取骨组织的三种类型细胞,即成骨细胞选择其祖细胞（BMSCs）和前体细胞系（MC3T3-E1）、破骨细胞前体（RAW264.7）和骨细胞（IDG-SW3）作为实验对象,进行以下实验:（1）利用小鼠的股骨来分离成骨细胞祖细胞,经流式细胞仪鉴定其表面受体,得到确认其为BMSCs细胞;利用核因子κB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）诱导破骨细胞前体7天后,进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）染色,确认其分化为TRACP阳性、多核的破骨细胞样细胞;利用矿化诱导液培养IDG-SW3细胞1442天后,采用Western Blot法检测到SOST蛋白表达阳性,确认其骨细胞特征;利用矿化诱导液培养成骨前体细胞728天,使其分化为成熟的成骨细胞;（2）利用浓度为0.00132 mg/L的氟离子处理成骨细胞、破骨细胞前体和骨细胞7天后,采用噻唑蓝（MTT）法检测骨组织中三种类型细胞的增殖活性。（3）利用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子联合其他条件处理三种细胞7天后,进行细胞的凋亡率分析。用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH（1-34）处理骨细胞7天;用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 ng/mL转化生长因子β1（TGF-β1）处理破骨细胞前体7天;用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 nmol/L PTH或相同氟浓度联合10 ng/mL TGF-β1处理成骨细胞祖细胞7天。各个实验结束后,采用美国BD公司的Annexin V-FITC凋亡试剂盒进行检测,观察骨组织三种细胞的凋亡情况。（4）利用明显影响细胞活性的,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理成骨细胞7天后,采用Western Blot法检测不同处理条件下,成骨细胞中Wnt10b、β连环蛋白（β-catenin）、Smad3、磷酸化Smad3、甲状旁腺素1受体（PTH1R）、核心结合因子2（Runx2）蛋白的表达变化;（5）利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10nmol/L的PTH处理骨细胞12天后,采用Western Blot法检测不同处理条件下,骨细胞中Smad3、磷酸化Smad3、硬化蛋白（SOST）、Dickkopf相关蛋白1（DKK1）、Wnt10b、β-catenin蛋白的表达变化。2.利用Transwell共培养骨组织细胞的染氟实验研究:利用孔径为3.0μm Polyester Membrance Transwell小室组成共培养系统,进行以下共培养实验:（1）将成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,利用明显影响破骨细胞活性,浓度为4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞7天。采用实时定量PCR法,检测两种共培养系统中骨细胞所分泌的SOST、DKK1、RANKL、骨保护素（OPG）基因的表达变化。（2）将成骨细胞祖细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体（比例为2:1）混合培养在下层。利用明显影响成骨细胞活性,浓度为0.5 mg/L的氟离子处理下层骨细胞,并用Caspase-Cas9 Sclerostin Activation转染质粒激活骨细胞中SOST蛋白表达48 h后。采用Diff-Quick Stain试剂盒进行染色,观察上层成骨细胞祖细胞增殖数量的变化。（3）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体（比例为2:1）混合培养在下层。利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞7天。上层成骨细胞通过碱性磷酸酶（ALP）染色检测其分化情况;下层骨细胞采用Western Blot法检测不同条件处理7天后,骨细胞内调控成骨相关信号通路蛋白的表达变化。（4）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞28天。上层成骨细胞通过茜素红染色检测其矿化结节形成情况;下层骨细胞采用Western Blot法检测不同条件处理28天,骨细胞内调控成骨相关信号通路蛋白的表达变化。（5）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层。利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞,并用50 nM SOST siRNA降低骨细胞中SOST蛋白表达48 h。采用实时定量PCR法,检测上层成骨细胞和下层骨细胞内相关基因的表达变化。实验结果:1.单独培养的骨组织细胞染氟实验结果:（1）流式细胞仪鉴定成骨细胞祖细胞（BMSCs）表现为CD34/CD44双阳性信号,证明成骨细胞祖细胞具有成骨分化的潜能;破骨细胞前体（RAW264.7）经RANKL诱导7天后进行TRACP染色,破骨细胞前体表现为三核或多核的TRACP阳性细胞,表明其已诱导成为破骨细胞样细胞;IDG-SW3细胞经矿化培养液诱导1442天,采用Western Blot法检测骨细胞标志物SOST蛋白的表达情况。实验结果表明,IDG-SW3细胞从21天开始表达骨细胞标志物硬化蛋白,直至42天仍表达硬化蛋白,证明其分化成为骨细胞。后续均选取矿化28天的IDG-SW3细胞进行实验研究。（2）细胞活性实验表明:氟对成骨细胞祖细胞作用范围窄,抑制作用较显着;破骨细胞前体对氟化物的作用比较敏感;成骨细胞活性整体呈现“倒U型”趋势,即随着氟浓度增加,成骨细胞活性逐渐增加,达到峰值后又逐渐下降;与其他骨组织细胞类型比较,骨细胞对氟离子的耐受性较强。（3）细胞凋亡实验表明:高剂量的氟显着促进骨组织中三种主要类型细胞的凋亡,氟联合PTH显着促进骨细胞的凋亡,TGF-β1轻度提高了破骨细胞前体的凋亡率,但PTH和TGF-β1对成骨细胞祖细胞的促凋亡作用不明显。（4）染氟或染氟联合PTH处理成骨细胞7天,蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟、染氟联合PTH不同程度的抑制了Wnt10b、β-catenin以及Runx2蛋白的表达,氟联合PTH处理与单独氟处理相比较,上面各因子的变化相类似。另外,染氟能够促进成骨细胞的Smad3蛋白的磷酸化。（5）染氟或染氟联合PTH处理骨细胞12天,蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟、染氟联合PTH处理,不同程度的下调SOST蛋白的表达,而上调DKK1蛋白表达。低剂量氟可以不同程度的促进Wnt10b、β-catenin、Smad3和P-Smad3蛋白的表达。氟联合PTH作用与单独氟处理相比较,Wnt10b和β-catenin蛋白的变化相类似。2.利用Transwell共培养骨组织细胞的染氟实验结果:（1）成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别与骨细胞进行共培养,染氟或染氟联合PTH处理下层成骨细胞7天,基因表达水平分析的结果显示:成骨细胞祖细胞与骨细胞共培养组中,骨细胞表达的SOST基因由染氟组轻度下降,到染氟联合PTH组显着下降,而DKK1基因的表达量正好与之相反,由染氟组轻度上升,到染氟联合PTH组显着上升。破骨细胞前体与骨细胞共培养组中,骨细胞表达的SOST基因由染氟组轻度下降,到染氟联合PTH组显着上升。而DKK1基因显着下降。另一方面,成骨细胞祖细胞与骨细胞共培养组中,骨细胞中RANKL/OPG的比值在单独染氟或染氟联合PTH处理条件下均显着下降。破骨细胞前体与骨细胞共培养组中,骨细胞中RANKL/OPG的比值由染氟组轻度上升,到染氟联合PTH组显着上升。（2）利用氟处理下层骨细胞,并用Caspase-Cas9 Sclerostin Activation转染质粒激活骨细胞中SOST蛋白表达48 h,上层成骨细胞祖细胞的迪夫染色结果显示:Transwell小室上层的成骨细胞祖细胞的个数,在氟处理骨细胞与破骨细胞混合培养组最低。其余各阳性激活SOST组,包括染氟的骨细胞或骨细胞与破骨细胞前体混合培养组,成骨细胞祖细胞的细胞数量也呈下降趋势。（3）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体混合培养在下层,染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞7天或28天,上层成骨细胞的碱性磷酸酶、茜素红染色结果显示:单独氟化物处理,刺激骨细胞诱导成骨细胞分化和成熟;而氟联合PTH处理,显着降低了成骨细胞的ALP活性,但刺激骨细胞诱导成骨细胞成熟。骨细胞与破骨细胞前体混合培养,单独染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞,上层成骨细胞分化趋势不明显。（4）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞7天和28天,下层骨细胞在蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟处理7天和28天,均显着促进骨细胞中β-catenin蛋白表达的以及Smad3蛋白的磷酸化,均抑制了骨细胞标志物SOST蛋白的表达。单独染氟或染氟联合PTH处理7天,不同程度促进骨细胞内Wnt10b和DKK1蛋白的表达。对比之下,单独染氟或染氟联合PTH处理28天,对骨细胞DKK1蛋白的表达影响不大。单独染氟28天,骨细胞中Wnt10b蛋白的表达量下降,而染氟联合PTH作用进一步抑制了Wnt10b蛋白的表达。（5）染氟和染氟联合PTH处理下层骨细胞,并用50 nM SOST siRNA技术降低骨细胞中SOST蛋白表达48 h,基因表达水平分析的结果显示:Transwell小室下层骨细胞SOST表达干扰成功,表现为各处理组骨细胞的SOST基因水平明显下降。单独氟化物处理,以及氟联合PTH处理骨细胞内DKK1基因的表达量上升,也不同程度促进RANKL和OPG基因的表达。与空白对照组比较,Tranwell上层成骨细胞在单独染氟处理组成骨细胞的标志物Runx2基因成轻度下降趋势,而成骨细胞中Smad3和Wnt10b基因的表达量上升,并且β-catenin基因的表达增加较为显着。低剂量氟联合PTH处理骨细胞,成骨细胞内成骨标志物ALP和Runx2基因的表达量显着增加,同时成骨细胞中的Smad3、wnt10b基因的表达量也是升高的。结论:本研究表明氟虽然不能直接刺激成骨细胞内Wnt10b/β-catenin以及Runx2的蛋白表达,但可以介导骨细胞内SOST和Wnt10b蛋白来发挥作用。SOST在氟化物影响骨细胞调控成骨细胞分化方面扮演着重要角色,其中Smad3蛋白磷酸化、Wnt10b/β-catenin等因子参与了氟对骨细胞调控成骨细胞分化的机制。PTH不仅影响SOST,而且可以调节骨细胞内其他因子来发挥刺激成骨的作用。
罗永珍[8]（2020）在《基于转录组学和蛋白质组学的小鼠氟中毒脑损伤研究》文中进行了进一步梳理氟在人类日常生活中分布非常广泛,虽然初期研究认为其能够改善龋齿等疾病,但后续研究揭示氟能够轻松穿透血脑屏障和胎盘,通过母婴之间胎盘和乳汁途径严重影响胎儿和新生儿的智力发育、造成神经细胞凋亡和炎症反应等。因此开展氟暴露对亲子代间神经系统损伤及其发育过程干扰的机制问题刻不容缓。在本研究中,通过亲子代小鼠连续给予10mg/L和50mg/L的NaF水溶液处理一定时间（亲代60d,子代30d）后,采集脑组织样品,随后提取其RNA和蛋白质,用转录组学研究及蛋白质组学研究手段,分别在低剂量氟处理小鼠、高剂量氟处理小鼠、以及亲子代之间进行对比分析,并对转录组和蛋白质组数据加以联合分析,而后全面绘制了不同氟剂量暴露和亲子代之间的基因响应图谱,并尝试找出产生这些影响的分子生物学机制及其关键调控基因和蛋白。结果显示:氟暴露对脑组织的影响并非与剂量呈效应关系。在亲代中,氟离子主要表现为对神经系统及神经元活动的抑制作用;在子代中,氟离子对脑组织免疫系统表现出显着提升现象,而对神经系统的抑制作用相对较弱。故此推测在子代神经发育过程中,可能存在着某种对氟损伤的自我修复机制。进一步联合网络分析也发现一系列关键调节因子,如:Notch1、Kit、Smad6、Lef1、Tal1等,不仅能够起到调控神经发育过程的作用,而且能够影响多个重要的细胞信号通路。本研究在组学层面对亲子代间长期氟暴露导致的神经功能损伤和神经发育过程干扰做了一定的探索,并提出了新的调控节点和信号通路网络,为下一步验证氟对神经系统的影响机制及保护措施提供科学依据。
杨兰[9]（2020）在《燃煤型氟中毒雌性大鼠雌激素变化对骨代谢及骨微结构的影响》文中指出第一部分:燃煤型氟中毒雌性大鼠模型的建立与鉴定目的:建立操作性强,病理特征明显的燃煤型地方性氟中毒雌性大鼠模型,为后续的机制研究奠定可靠的模型基础。方法:清洁级断乳2周的SD雌性大鼠150只,适应性喂养1周后,随机分为5组:对照组、低氟组、中氟组、高氟组、去卵巢组,每组30只。分别饲以不同氟含量（0、25、45、110、0mg/kg）的饲料150天,每月称量雌鼠体重,观察记录氟斑牙发生情况,分别于造模90、120、150天时处死处于动情期的大鼠10只/组,处死前收集尿液,用氟离子电极法检测尿氟含量,取雌鼠右下肢股骨,用高温灰化法测量骨氟含量。结果:对照组与去卵巢组雌鼠无氟斑牙情况发生,各染氟组大鼠氟斑牙检出率随剂量增加而增加,氟斑牙损伤程度与剂量呈线性相关关系（?2=6.273,P<0.05）。除低氟组外,余染氟组尿氟含量均高于对照组（P<0.05）,并随时间延长和染氟剂量增加而增加;除90天、150天的低氟组外,其余各染氟组雌鼠骨氟含量均高于对照组（P<0.05）,并随染氟时间延长和染氟剂量增加而增加。去卵巢组大鼠性周期停留在动情间期。结论:成功建立了燃煤型地方性氟中毒雌性大鼠模型和去卵巢大鼠模型。第二部分:燃煤型氟中毒对雌性大鼠性激素及骨代谢和骨微结构的影响目的:通过检测各组雌性大鼠血清E2、骨代谢因子含量和骨微结构参数的变化,探讨氟中毒对雌性大鼠E2、骨代谢及骨微结构三方面的影响。方法:取各组雌性大鼠血清离心后,采用放射免疫法测定大鼠血清E2含量,采用酶联免疫吸附法测定血清骨代谢因子和各组大鼠卵巢组织匀浆的IGF-1的含量,采用显微CT技术检测各组大鼠左侧股骨的BMD和其他各项骨微结构参数。结果:1、E2变化情况及机制:90天时,中高氟组大鼠血清E2高于对照组和低氟组,差异有统计学意义（P<0.05）,120天时,各染氟组大鼠血清E2均低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,150天时,高氟组大鼠血清E2显着低于对照组和低氟组（P<0.05）,高氟组后期大鼠血清E2显着低于90天,差异有统计学意义（P<0.05）。120天时,中高氟组大鼠卵巢IGF-1表达低于对照组（P<0.05）,高氟组低于低氟组（P<0.05）,150天时,各染氟组大鼠卵巢IGF-1表达均低于对照组（P<0.05）,高氟组显着低于低氟组（P<0.05）,中高氟组大鼠卵巢IGF-1表达中后期低于早期水平（P<0.05）。2、骨代谢因子变化情况:150天时,高氟组雌鼠BALP显着低于正常对照组和低氟组（P<0.05）,中高氟组雌鼠BALP含量染氟后期降低（P<0.05）;90天时,中高氟组雌鼠血清TRACP-5b含量低于对照组（P<0.05）,120天时,各染氟组大鼠血清TRACP-5b含量均高于对照组（P<0.05）,且有剂量依赖性,150天时,各染氟组大鼠血清TRACP-5b含量均高于对照组（P<0.05）,中氟组高于低氟组（P<0.05）,染氟120天和150天时,大鼠血清TRACP-5b含量高于早期水平（P<0.05）;IGFs家族中,去卵巢组雌鼠血清IGF-1和IGFBP5均低于正常对照组（P<0.05）,IGFBP4高于对照组（P<0.05）,120天时,高氟组IGF-1低于其余各组（P<0.05）,中氟组低于低氟组（P<0.05）,150天时,中高氟组大鼠血清IGF-1低于对照组和低氟组,差异均有统计学意义（P<0.05）,且高氟组低于中氟组（P<0.05）,氟中毒雌鼠血清IGF-1含量:90天>120天>150天,差异均有统计学意义（P<0.05）。90天时,中氟组大鼠IGFBP4高于低氟组（P<0.05）,120天时,中高氟组大鼠IGFBP4高于对照组和低氟组,差异均有统计学意义（P<0.05）,150天时,各染氟组大鼠IGFBP4均高于对照组（P<0.05）,有剂量依赖效应,中高氟组大鼠IGFBP4含量:90天<120天<150天,差异均有统计学意义（P<0.05）。150天时,中高氟组IGFBP5含量较对照组和低氟组有所降低（P<0.05）,并高于90天时（P<0.05）。3、BMD与骨微结构变化情况:90天时,高氟组大鼠BMD高于对照组和低氟组,差异均有统计学意义（P<0.05）,120天时,低氟组BMD大于对照组（P<0.05）,中高氟组大鼠BMD低于低氟组（P<0.05）,高氟组大鼠BMD低于对照组和中氟组（P<0.05）,150天时,低氟组大鼠BMD高于对照组（P<0.05）,中高氟组随剂量增加而降低。低氟组大鼠BMD:90天<120天<150天,差异均有统计学意义（P<0.05）,中高氟组与之相反。大鼠TMD变化与BMD一致。BV/TV低氟组均高于对照组（P<0.05）,中高氟组90天时高于对照组（P<0.05）,且高氟组>中氟组（P<0.05）,120天和150天时低于对照组（P<0.05）,且中氟组>高氟组（P<0.05）。BS/BV:90天时,高氟组高于对照组和低氟组（P<0.05）,150天时,各染氟组均低于对照组（P<0.05）。BS/TV:90天时,中高氟组高于对照组（P<0.05）,150天时,高氟组低于中氟组（P<0.05）。Tb.Sp:90天时,低、中氟组低于对照组（P<0.05）,120天和150天时,中高氟组高于对照组（P<0.05）,有剂量依赖效应。Tb.N:90天时,各染氟组均高于对照组（P<0.05）,120天和150天时,中高氟组均低于对照组（P<0.05）,有剂量依赖效应,低氟组高于对照组（P<0.05）。Tb.Th:90天时,各染氟组均高于对照组（P<0.05）,150天时,中高氟组低于低氟组（P<0.05）。Conn.D:氟中毒大鼠Conn.D均低于对照组,除150天时,差异均有统计学意义（P<0.05）。SMI:90天时,中高氟组均低于对照组（P<0.05）,120天和150天则相反。DA:90天时,中高氟组低于对照组和低氟组,差异均有统计学意义（P<0.05）。Tb.Pf:90天时,对照组>中氟组>高氟组（P<0.05）,120天和150天时,低氟组低于对照组（P<0.05）,中高氟组高于低氟组（P<0.05）。结论:1、氟中毒可能通过下调卵巢组织IGF-1的表达量而降低了E2的分泌水平。2、氟中毒对雌性大鼠的骨转换状态具有双向性。3、氟中毒对雌鼠骨微结构的影响具有双向性。第三部分:燃煤型氟中毒雌性大鼠雌激素变化对骨代谢及骨微结构的影响目的:探讨氟中毒引起的雌性大鼠E2水平变化对骨代谢因子和骨微结构影响。方法:对染氟剂量、雌鼠血清E2水平,各骨代谢因子/骨微结构进行双变量相关分析,判断调节效应分析的合理性。运用Process插件将染氟剂量、雌鼠血清E2水平纳入自变量,把各骨代谢因子/骨微结构作为因变量进行多元回归分析,检验交互项“染氟剂量*E2”显着水平,判断调节效应存在与否,及具体调节方式。结果:1、雌鼠机体E2含量在染氟剂量与血清IGF-1的关系中起正调节作用（β=0.301,P<0.05）,该调节作用可单独解释11.9%血清IGF-1变异量,E2含量降低会增强氟对血清IGF-1表达的抑制作用,且随着E2含量的进行性降低,这种抑制效果更加明显（斜率由-0.081到-0.682,P<0.05）。2、雌鼠机体E2含量在染氟剂量与血清IGFBP4的关系中起负调节作用（β=-0.261,P<0.05）,该调节作用可单独解释9%血清IGFBP4变异量,E2含量降低会增强氟对血清IGFBP4的上调作用,并随着E2含量的进行性降低,这种增强作用更加明显（斜率由0.230到0.752,P<0.05）。3、雌鼠机体E2含量在染氟剂量与血清IGFBP5的关系中的正调节作用（β=0.175,P=0.056）处于边缘化,经Johnson-Neyman法剖析后,除当E2=38.71ng/dl时该调节效应不存在,E2含量降低会增强氟对血清IGFBP5的抑制作用。4、雌鼠机体E2含量在染氟剂量与血清TRACP-5b的关系中起负调节作用（β=-0.218,P<0.05）,该调节作用可单独解释6.3%血清TRACP-5b变异量,E2含量降低会增强氟对血清TRACP-5b的促进作用,并随着E2含量的进行性降低,这种增强作用更加明显（斜率由0.201到0.637,P<0.05）。5、雌鼠机体E2含量在染氟剂量与血清BALP的关系中的不存在调节作用（β=0.088,P=0.379）。6、雌鼠机体E2含量能调节染氟剂量与骨量、骨小梁形态结构的关系。结论:氟中毒引起的雌鼠E2含量降低能进一步下调IGFs家族内促生长因子IGF-1、IGFBP5的表述,并上调IGFBP4的表达,同时进一步促进骨吸收活性,影响骨转换,进而导致骨微结构改变,发生氟骨症。
邵丹丹[10]（2020）在《氟暴露下小鼠脑海马钙稳态变化分子机制的研究》文中提出氟（fluorine,F）是人体必需微量元素,过量氟蓄积造成机体全身性生理病理改变,称为地方性氟中毒,简称地氟病。氟斑牙、氟骨症是氟暴露致骨相器官受损的主要症状。氟暴露还能导致脑、肾脏等非骨相器官受损。研究表明,过量氟摄入可透过血脑-屏障蓄积在脑组织中,影响中枢神经系统的正常生理功能。近年来,氟中毒致神经系统的影响已成为地氟病研究的热点。Ca2+是机体细胞内重要的“第二信使”,钙稳态是细胞Ca2+信号生成转导,完成一系列生理功能的关键,但迄今氟暴露致脑海马组织钙稳态变化的分子机制及膳食钙水平的影响尚未见系统报道。本实验分为亚慢性氟和慢性氟暴露两部分,各选用初断乳ICR雄性小鼠120只,适应7天后,随机分为6组,即对照组（C）:饮用自来水（氟含量<0.2 mg/L）,食用标准饲料（钙含量0.8%）;染氟组（F）:饮用100 mg/LNaF溶液,食用标准饲料;高钙组（HCa）:饮用自来水,食用高钙饲料（钙含量2%）;低钙组（LCa）:饮用自来水,食用低钙饲料（钙含量0.063%）;染氟高钙组（F+HCa）:饮用100 mg/L NaF溶液,食用高钙饲料;染氟低钙组（F+LCa）:饮用100 mg/L NaF溶液,食用低钙饲料。染氟结束后,观测小鼠氟斑牙,并检测其血/尿氟、血/尿钙含量,在检验小鼠氟中毒模型复制成功的基础上,观测小鼠海马组织CA1区形态结构和细胞凋亡率;fluo-4荧光探针负载检测小鼠海马细胞内Ca2+水平;根据试剂盒方法检测小鼠海马细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性;用Western Blot、RT-PCR等方法检测小鼠海马细胞膜L型钙通道Cav1.2、质膜Ca2+泵PMCA、Na+-Ca2+交换体NCS-1、内质网膜肌醇三磷酸受体IP3R和钙泵ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平,拟首次系统探讨不同膳食钙水平对氟致脑海马钙稳态变化的影响及分子机制,为探寻氟致神经毒性经济有效的干预途径及完善“氟致钙矛盾疾病”理论提供基础资料。研究结果如下:（1）小鼠氟中毒模型的复制与C组比,亚慢性氟暴露和慢性氟暴露各氟处理组氟斑牙症状明显,尿氟含量极显着上升（P<0.01）,表明本研究小鼠亚慢性氟暴露和慢性氟暴露模型复制成功。（2）小鼠海马组织形态结构观察亚慢性和慢性氟暴露C组小鼠海马CA1区细胞形态规则,细胞正常,界限清晰,结构紧密,层次明显。F组小鼠海马CA1区细胞形态发生改变,细胞间隙较宽,排列疏松。与F组比,F+HCa组较细胞排列较紧密,有清晰的细胞分层,而F+LCa组细胞染色较浅,细胞数量明显减少且间隙较宽。（3）小鼠海马CA1区细胞凋亡检测结果与C组比,亚慢性氟暴露和慢性氟暴露各处理组小鼠CA1区细胞凋亡数量极显着上升（P<0.01）;与F组比,亚慢性氟暴露和慢性氟暴露F+HCa组小鼠CA1区细胞凋亡数量极显着减少（P<0.01）,而亚慢性氟暴露和慢性氟暴露F+LCa组小鼠CA1区细胞凋亡数量却极显着增加（P<0.01）;与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组和F+LCa组小鼠CA1区细胞凋亡数量显着增加（P<0.05）。（4）小鼠海马细胞内Ca2+水平检测结果与C组比,亚慢性氟暴露和慢性氟暴露各染氟组小鼠海马细胞内Ca2+水平均显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）;与F组比,亚慢性和慢性氟暴露F+HCa组小鼠海马细胞内Ca2+水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）,F+LCa组小鼠海马细胞内Ca2+水平显着升高（P<0.05）;与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组,F+HCa组和F+LCa组小鼠海马细胞内Ca2+水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）。（5）小鼠海马细胞Ca2+转运相关分子检测结果a、跨膜摄入Ca2+的相关分子检测结果与C组比,各染氟处理组小鼠海马细胞膜Cav1.2基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）;与F组比,F+HCa组Cav1.2基因/蛋白表达水平极显着降低（P<0.05或P<0.01）,ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,F+LCa组Cav1.2基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组、F+HCa组和F+LCa组Cav1.2基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。b、Ca2+跨膜释出相关指标检测结果小鼠海马组织细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性检测结果显示,与C组比,各处理组Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力均显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）;与F组比,F+HCa组Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力显着升高（P<0.05）,F+LCa组Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力显着降低（P<0.05）;与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组和F+LCa组Na+-K+-ATP酶活力显着降低（P<0.05）。与C组比,各染氟处理组小鼠海马细胞内质网膜IP3R基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,海马细胞质膜NCS-1、PMCA基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）;与F组比,F+HCa组IP3R基因/蛋白表达水平极显着降低（P<0.05或P<0.01）,NCS-1、PMCA基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,F+LCa组IP3R基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,NCS-1、PMCA基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。与亚慢性氟暴露比,慢性氟暴露F组、F+HCa组和F+LCa组小鼠海马细胞内IP3R基因/蛋白表达水平显着或极显着升高（P<0.05或P<0.01）,NCS-1、PMCA基因/蛋白表达水平显着或极显着降低（P<0.05或P<0.01）。综上所述,氟中毒致脑海马细胞L-型钙离子通道Cav1.2基因/蛋白表达水平上升,使细胞外Ca2+的内流增加;同时细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性降低,Na+-Ca2+交换体NCS-1和质膜Ca2+泵PMCA基因/蛋白表达水平也降低,使细胞内Ca2+逆浓度向质膜外运转受阻;而脑海马细胞内通过升高内质网IP3R通道基因/蛋白表达水平,并降低钙泵ATP2A2/SERCA2基因/蛋白表达水平,使细胞内主要钙库内质网中Ca2+释出增多,并使内质网逆浓度从胞液中摄取Ca2+受阻。上述多因素导致细胞质中Ca2+超载,使脑海马细胞Ca2+稳态失衡,触发钙信号通路和下游凋亡调节相关分子表达异常,诱发脑海马细胞凋亡异常,最终损伤脑海马组织细胞,且氟致脑脑海马细胞凋亡率与染氟时间呈正相关。而膳食高钙（2%）能够显着地逆转上述氟暴露致脑海马细胞膜或内质网膜Ca2+转运相关分子表达的异常,抑制细胞内Ca2+超载,维持钙稳态,降低细胞凋亡率,膳食高钙可能是一种经济、安全且有效的抗氟剂。
二、氟对大鼠骨ROS和RNA含量的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、氟对大鼠骨ROS和RNA含量的影响（论文提纲范文）
（1）六味地黄丸对H2O2致MC3T3-E1细胞氧化损伤的保护机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验细胞 |
| 1.3 实验药物 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 实验试剂 |
| 1.6 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 六味地黄丸含药血清的制备 |
| 2.2 MC3T3-E1 细胞的培养 |
| 2.3 实验分组及各实验指标的具体检测方法 |
| 3 数据统计与分析 |
| 4 技术路线图 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 过氧化氢对MC3T3-E1 细胞活力的影响 |
| 5.2 六味地黄丸含药血清对过氧化氢致MC3T3-E1 细胞活力下降的干预作用 |
| 5.3 六味地黄丸含药血清对过氧化氢致MC3T3-E1 细胞ROS水平改变的影响 |
| 5.4 六味地黄丸含药血清对过氧化氢诱导 MC3T3-E1 细胞 Runx 2、Beclin 1 蛋白表达的影响 |
| 5.5 六味地黄丸含药血清对过氧化氢诱导 MC3T3-E1 细胞 Runx 2、Beclin 1、LC3B mRNA 表达的影响 |
| 分析与讨论 |
| 1 六味地黄丸对过氧化氢致MC3T3-E1 细胞活力和ROS水平改变的影响 |
| 1.1 六味地黄丸的药理作用 |
| 1.2 六味地黄丸对过氧化氢致成骨细胞活力改变的影响 |
| 1.3 六味地黄丸对过氧化氢致成骨细胞ROS水平改变的影响 |
| 2 六味地黄丸对过氧化氢诱导 MC3T3-E1 细胞 Runx 2、Beclin 1、LC3B表达的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 自噬对骨组织氧化应激损伤调控作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）晚期氧化蛋白产物影响骨细胞硬骨素表达参与增龄性骨量丢失的作用与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 AOPPs对骨组织内sclerostin表达的影响及其在增龄性骨量丢失中的作用 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 AOPPs提高骨细胞sclerostin表达的分子机制 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 阻断AOPPs作用途径对其诱导增龄性骨量丢失的干预作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 缩略语词汇表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（3）NRH：醌氧化还原酶2介导慢性氟中毒大鼠脑组织氧化应激损伤及自噬功能改变的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 自噬与脑损伤 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（4）不同钙水平下氟暴露致肾脏损伤作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRCT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 地氟病对机体的损害 |
| 1.1.1 地氟病对骨相器官的损害 |
| 1.1.2 地氟病对非骨相器官的危害 |
| 1.2 氟中毒的发病机制 |
| 1.2.1 氟致氧化应激学说 |
| 1.2.2 氟致细胞凋亡 |
| 1.3 钙与氟中毒 |
| 1.3.1 钙的生物学效应 |
| 1.3.2 钙与氟的研究进展 |
| 1.3.3 L-型钙通道与氟中毒的研究进展 |
| 1.4 钙与TNF-α /TNFR1 信号通路 |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物与分组 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠体重、肾脏重量以及肾脏脏器系数测定 |
| 2.3.2 肾脏血液相关指标测定 |
| 2.3.3 肾脏组织中总蛋白含量检测 |
| 2.3.4 小鼠肾脏组织形态结构观察 |
| 2.3.5 TUNEL法观测小鼠肾脏细胞凋亡情况 |
| 2.3.6 小鼠肾脏细胞内Ca~(2+)水平观测 |
| 2.3.7 小鼠肾脏细胞ROS检测 |
| 2.3.8 RT-PCR检测m RNA表达 |
| 2.3.9 Western Blot检测小鼠肾脏组织相关蛋白表达 |
| 2.4 统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 氟暴露对小鼠体重及脏器系数的影响 |
| 3.2 肾脏损伤相关血液指标的测定结果 |
| 3.3 小鼠肾脏组织形态学观察结果 |
| 3.4 小鼠肾脏细胞凋亡检测结果 |
| 3.4.1 肾脏细胞凋亡观察 |
| 3.4.2 肾脏细胞凋亡率 |
| 3.5 小鼠肾脏组织细胞内Ca~(2+)水平测定结果 |
| 3.5.1 小鼠肾脏组织细胞内Ca~(2+)荧光探针负载 |
| 3.5.2 小鼠肾脏组织细胞内Ca~(2+)水平测定结果 |
| 3.6 小鼠肾脏组织细胞内活性氧ROS水平测定结果 |
| 3.7 氟暴露对小鼠肾脏相关基因表达的影响 |
| 3.7.1 小鼠肾脏细胞膜L型钙离子通道Cav1.2 基因表达水平检测统计结果 |
| 3.7.2 小鼠肾脏细胞内死亡受体信号转导通路分子基因表达水平检测统计结果 |
| 3.7.3 小鼠肾脏细胞内下游凋亡调节因子基因表达水平检测统计结果 |
| 3.8 氟暴露对小鼠肾脏相关蛋白表达的影响 |
| 3.8.1 小鼠肾脏细胞膜L型钙离子通道Cav1.2 蛋白表达水平检测统计结果 |
| 3.8.2 小鼠肾脏细胞内死亡受体信号转导通路分子蛋白表达水平检测统计结果 |
| 3.8.3 小鼠肾脏细胞内下游凋亡调节因子蛋白表达水平检测统计结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
（5）氟化物对发育性髋关节发育不良发病易感性的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 生命早期高氟暴露对DDH发病率的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试剂的配制 |
| 2.2.2 发育性髋关节发育不良联合饮水型氟中毒大鼠动物模型的建立 |
| 2.2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 生命早期高氟暴露对大鼠体重的影响 |
| 3.2 生命早期高氟暴露对大鼠门齿氟斑牙患病率的影响 |
| 3.3 生命早期高氟暴露对大鼠DDH发生率的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 氟化物对大鼠髋关节囊形态结构及功能的影响及其作用机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试剂的配制 |
| 2.2.2 饮水型氟中毒大鼠动物模型的建立 |
| 2.2.3 髋关节病理玻片制作 |
| 2.2.4 扫描电子显微镜 |
| 2.2.5 透射电子显微镜 |
| 2.2.6 Masson染色 |
| 2.2.7 实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应 |
| 2.2.8 免疫蛋白印迹 |
| 2.2.9 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色 |
| 2.2.10 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 生命早期不同氟化物浓度对大鼠体重发育的影响 |
| 3.2 各染氟组大鼠髋关节关节囊胶原纤维形态的改变 |
| 3.3 各染氟组大鼠髋关节关节囊超微结构的改变 |
| 3.4 各染氟组胶原及凋亡相关基因mRNA表达差异 |
| 3.5 各染氟组关节囊组织凋亡程度不同 |
| 3.6 各染氟组关节囊胶原以及凋亡相关蛋白表达水平差异 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 氟化物对髋关节囊原代成纤维细胞胶原代谢的影响及其作用机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试剂配制 |
| 2.2.2 大鼠关节囊成纤维细胞原代培养 |
| 2.2.3 大鼠关节囊成纤维细胞的传代培养 |
| 2.2.4 细胞鉴定 |
| 2.2.5 细胞存活率测定 |
| 2.2.6 大鼠关节囊原代成纤维细胞的氟化钠处理 |
| 2.2.7 透射电镜 |
| 2.2.8 细胞免疫荧光 |
| 2.2.9 实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应 |
| 2.2.10 免疫蛋白印迹 |
| 2.2.11 线粒体膜电位水平(JC-10)检测 |
| 2.2.12 细胞内活性氧自由基水平检测 |
| 2.2.13 细胞内脂质过氧化水平检测 |
| 2.2.14 细胞总抗氧化能力检测 |
| 2.2.15 细胞过氧化氢酶活力水平检测 |
| 2.2.16 细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力检测 |
| 2.2.17 凋亡细胞的流式分析检测 |
| 2.2.18 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 原代成纤维细胞的鉴定 |
| 3.2 NaF对关节囊原代成纤维细胞形态的影响 |
| 3.3 NaF干预下关节囊原代成纤维细胞的存活率 |
| 3.4 NaF对关节囊原代成纤维细胞Col1a1和Col3a1表达的影响 |
| 3.5 NaF对关节囊成纤维细胞内线粒体膜电位水平的影响 |
| 3.6 NaF对关节囊成纤维细胞内超微结构的影响 |
| 3.7 NaF对关节囊原代成纤维细胞内ROS、MDA含量、CAT活力、SOD活力以及总AOC的影响 |
| 3.8 NaF对关节囊原代成纤维细胞凋亡情况的影响 |
| 3.9 NaF对关节囊原代成纤维细胞凋亡相关基因mRNA水平的影响 |
| 3.10 NaF对关节囊原代成纤维细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 长期摄入过量氟化物所致非骨相损害的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）蕨麻黄酮对镉氧化毒性介导骨质疏松症的干预作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1.OP发病与氧化应激的相关性 |
| 2.氧化应激介导OP的机制 |
| 3.Cd毒性与氧化应激 |
| 4.中医学对OP病因病机的认识与防治 |
| 5.黄酮类化合物及其生物活性 |
| 6.黄酮类化合物提取方法 |
| 7.本研究的目的和意义 |
| 8.技术路线 |
| 实验一 微波辅助乙醇提取PAF工艺的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与实验材料 |
| 1.2 实验设备仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 芦丁标准曲线 |
| 2.2 定性结果分析 |
| 2.3 实验方法评估 |
| 2.4 LC-MS检测PAF结果 |
| 2.5 PAF提取单因素结果分析 |
| 2.6 正交试验结果 |
| 3 小结 |
| 实验二 Cd的氧化毒性与OP动物模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 动物实验 |
| 1.4 统计分析 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 Cd染毒对MC3T3-E1细胞的影响 |
| 2.2 Cd染毒致小鼠OP模型的建立 |
| 3.小结 |
| 实验三 PAF体外抗氧化活性及细胞内药效研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 体外抗氧化实验方法 |
| 1.3 PAF细胞内药效实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 PAF体外抗氧化实验结果 |
| 2.2 PAF细胞内药效实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验四 PAF干预对Cd诱导MC3T3-E1细胞凋亡的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 PAF干预对Cd染毒MC3T3-E1细胞活性的影响 |
| 2.2 PAF干预Cd诱导MC3T3-E1细胞凋亡的影响 |
| 2.3 PAF干预对Cd染毒MC3T3-E1细胞氧化应激的影响 |
| 2.4 PAF干预对Cd染毒MC3T3-E1细胞[Ca~(2+)]i的影响 |
| 2.5 PAF干预对Cd染毒MC3T3-E1细胞MMP的影响 |
| 2.6 PAF干预对Cd染毒MC3T3-E1细胞FoxO/Wnt信号通路影响 |
| 3 小结 |
| 实验五 PAF对Cd染毒小鼠骨质疏松的保护效应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 一般观察 |
| 2.2 PAF干预对Cd染毒小鼠骨密度和骨形态计量学的影响 |
| 2.3 PAF干预对Cd染毒小鼠骨生物力学的影响 |
| 2.4 PAF干预对Cd染毒小鼠血清骨转换指标的影响 |
| 2.5 PAF干预对Cd诱导骨细胞凋亡的影响 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 1.关于PAF提取方法与最佳提取条件 |
| 2.关于PAF抗氧化药效及其作用机制 |
| 3.关于Cd的氧化毒性与OP动物模型的建立 |
| 4 关于Cd的氧化毒性及其致细胞凋亡的作用机制 |
| 5.PAF干预Cd致骨质疏松的途径 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）氟对骨细胞调控成骨作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 代谢性骨病 |
| 1.1 代谢性骨病发病机制 |
| 1.2 代谢性骨病——骨质疏松症 |
| 1.3 代谢性骨病——侏儒症 |
| 1.4 代谢性骨病——骨软化症 |
| 第2章 骨细胞在代谢性骨病中的作用 |
| 2.1 骨细胞 |
| 2.2 骨细胞参与骨的生理性重建 |
| 第3章 氟骨症的机制研究进展 |
| 3.1 氟元素与氟骨症 |
| 3.2 氟骨症发病机理 |
| 第4章 成骨细胞在氟骨症中的作用 |
| 4.1 成骨细胞与骨形成 |
| 4.2 成骨细胞在氟骨症发病机制中的作用 |
| 第5章 研究设想及意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第1章 单独培养骨组织细胞染氟实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验细胞株 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验器械 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 骨组织细胞的诱导培养及鉴定 |
| 1.2.1.1 小鼠骨髓成骨细胞祖细胞(BMSCS)的分离、培养及鉴定 |
| 1.2.1.2 IDG-SW3 细胞的矿化诱导培养及检测 |
| 1.2.1.3 RAW264.7 细胞的诱导培养及检测 |
| 1.2.1.4 MC3T3-E1 细胞的诱导培养 |
| 1.2.2 MTT法检测骨组织细胞的增殖活性 |
| 1.2.3 流式细胞仪检测骨组织细胞的凋亡率 |
| 1.2.4 Western Blot法检测成骨细胞内相关蛋白的表达 |
| 1.2.5 Western Blot法检测骨细胞内相关蛋白的表达 |
| 1.2.6 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 骨组织中BMSCs、IDG-SW3和RAW264.7 细胞的鉴定 |
| 1.3.1.1 BMSCs细胞上表面抗原的测定 |
| 1.3.1.2 IDG-SW3 细胞经矿化诱导成为骨细胞的测定 |
| 1.3.1.3 RAW264.7 细胞经RANKL诱导成为破骨细胞样细胞的测定 |
| 1.3.2 染氟不同时间不同浓度对骨组织中细胞增殖活性的影响 |
| 1.3.3 染氟不同浓度对骨组织中细胞凋亡的影响 |
| 1.3.4 染氟成骨细胞内特征性蛋白的表达变化 |
| 1.3.4.1 染氟成骨细胞内Smad3/P-Smad3以及Wnt10b/β-catenin蛋白的表达 |
| 1.3.4.2 染氟成骨细胞内Runx2和PTH1R蛋白的表达 |
| 1.3.5 染氟骨细胞内调控成骨和破骨相关蛋白的表达 |
| 1.3.5.1 染氟骨细胞内SOST、 DKK1、以及Wnt10b/β-catenin蛋白的表达 |
| 1.3.5.2 染氟骨细胞内Smad3/P-Smad3 蛋白的表达 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 共培养骨组织细胞染氟实验研究 |
| 2.1 共培养实验材料 |
| 2.1.1 共培养实验细胞株 |
| 2.1.2 共培养实验仪器 |
| 2.1.3 共培养实验试剂 |
| 2.1.4 共培养实验器材 |
| 2.2 共培养实验方法 |
| 2.2.1 PCR法检测成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别与骨细胞共培养系统中下层骨细胞特定基因的表达变化 |
| 2.2.2 激活骨细胞的SOST对成骨细胞祖细胞增殖的影响 |
| 2.2.3 成骨细胞与骨细胞共培养7 天 |
| 2.2.4 成骨细胞与骨细胞共培养28 天 |
| 2.2.5 干扰骨细胞中的SOST对成骨细胞活性的影响 |
| 2.2.5.1 筛选siRNA最适浓度 |
| 2.2.5.2 实验流程 |
| 2.2.6 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 成骨细胞祖细胞和破骨细胞前体对骨细胞内成骨、破骨调控基因表达的影响 |
| 2.3.1.1 成骨细胞祖细胞对骨细胞内成骨、破骨调控基因表达的影响 |
| 2.3.1.2 破骨细胞前体对骨细胞内成骨、破骨调控基因表达的影响 |
| 2.3.2 激活骨细胞中SOST经迪夫染色观察成骨细胞祖细胞的增殖 |
| 2.3.3 染氟骨细胞对共培养系统中成骨细胞分化的影响 |
| 2.3.3.1 通过碱性磷酸酶染色观察Transwell小室上层成骨细胞分化的情况 |
| 2.3.3.2 Transwell小室下层染氟7 天骨细胞内调控成骨相关信号通路因子的变化 |
| 2.3.4 染氟骨细胞对共培养系统中成骨细胞矿化成熟的影响 |
| 2.3.4.1 通过茜素红染色观察Transwell小室上层成骨细胞矿化结节形成的情况 |
| 2.3.4.2 Transwell小室下层染氟28 天骨细胞内调控成骨相关信号通路因子的变化 |
| 2.3.5 干扰骨细胞表达SOST对骨细胞内调控成骨、破骨相关因子的影响 |
| 2.3.5.1 siRNA最适浓度 |
| 2.3.5.2 干扰染氟骨细胞中SOST的表达对共培养系统中骨细胞内调控成骨、破骨基因表达的影响 |
| 2.3.5.3 干扰染氟骨细胞中SOST的表达对共培养系统中成骨细胞内相关因子表达的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三篇 讨论与结论 |
| 第四篇 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）基于转录组学和蛋白质组学的小鼠氟中毒脑损伤研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 地氟病的概述 |
| 1.1.1 地氟病的形成 |
| 1.1.2 地氟病对人体的影响 |
| 1.1.3 氟中毒对脑组织影响机制的研究现状 |
| 1.2 转录组学研究 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 RNA-seq技术 |
| 1.3 蛋白质组学研究 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 基于质谱的蛋白质组学 |
| 1.3.3 数据获取及分析 |
| 1.4 转录组和蛋白质组学技术在氟中毒影响机制研究中的应用 |
| 1.5 本研究的目的 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂配常制 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 动物饲养及样品采集 |
| 2.3.2 转录组学研究 |
| 2.3.3 蛋白组学研究 |
| 2.3.4 转录组与蛋白质组数据联合分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 转录组结果与分析 |
| 3.1.1 总RNA质控分析 |
| 3.1.2 参考基因组比对区域分布 |
| 3.1.3 基因表达值的分布统计图 |
| 3.1.4 显着差异基因分布 |
| 3.1.5 显着差异基因表达分析 |
| 3.1.6 差异基因表达水平聚类分析 |
| 3.1.7 差异基因GO富集分析 |
| 3.1.8 差异基因KEGG富集分析 |
| 3.2 蛋白组结果与分析 |
| 3.2.1 蛋白质样品数据重复性分析 |
| 3.2.2 氟中毒小鼠脑组织蛋白表达谱显着差异蛋白分布 |
| 3.2.3 差异蛋白GO富集分析 |
| 3.2.4 差异蛋白的KEGG富集性分析 |
| 3.3 转录组和蛋白组联合分析 |
| 3.3.1 GSEA转录组模块筛选 |
| 3.3.2 转录组与蛋白质组种子基因网络构建 |
| 3.4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）燃煤型氟中毒雌性大鼠雌激素变化对骨代谢及骨微结构的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分:燃煤型氟中毒雌性大鼠模型的建立与鉴定 |
| 材料与方式 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分:燃煤型氟中毒对雌性大鼠性激素及骨代谢和骨微结构的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分:燃煤型氟中毒雌性大鼠雌激素变化对骨代谢及骨微结构的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 氟骨症发病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（10）氟暴露下小鼠脑海马钙稳态变化分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRCT |
| 符号说明 |
| 1 绪论 |
| 1.1 地氟病对机体的危害 |
| 1.1.1 地氟病对骨相器官的危害 |
| 1.1.2 地氟病对非骨相器官的危害 |
| 1.2 氟中毒的发病机制 |
| 1.2.1 氟致氧化应激学说 |
| 1.2.2 氟致细胞凋亡 |
| 1.3 钙与氟中毒 |
| 1.3.1 氟致钙矛盾疾病理论 |
| 1.3.2 Ca~(2+)跨膜摄取 |
| 1.3.3 Ca~(2+)跨膜释出 |
| 1.3.3.1 细胞质中 Ca~(2+)的释出 |
| 1.3.3.2 胞内钙池Ca~(2+)的释放 |
| 1.4 研究意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物与分组 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 小鼠下切齿观察 |
| 2.4.2 小鼠血氟,血钙,尿氟,尿钙含量检测 |
| 2.4.3 HE染色观察小鼠海马组织CA1区形态结构 |
| 2.4.4 TUNEL法观测小鼠海马CA1 区细胞凋亡情况 |
| 2.4.5 小鼠海马细胞内Ca~(2+)水平观测 |
| 2.4.6 小鼠海马组织Na~+-K~+-ATP酶,Ca~(2+)-ATP酶活力检测 |
| 2.4.7 RT-PCR检测小鼠海马组织相关基因表达 |
| 2.4.8 Western Blot检测小鼠海马组织相关蛋白表达 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 氟中毒小鼠模型制备 |
| 3.1.1 小鼠氟斑牙观察结果 |
| 3.1.2 小鼠血氟、尿氟、血钙、尿钙测定结果 |
| 3.2 小鼠海马CA1区细胞形态结构观察结果 |
| 3.3 小鼠海马CA1区细胞凋亡观测结果 |
| 3.3.1 海马CA1区细胞凋亡观察 |
| 3.3.2 海马CA1区细胞凋亡率 |
| 3.4 小鼠海马组织细胞内Ca~(2+)水平测定结果 |
| 3.4.1 小鼠海马组织细胞内Ca~(2+)荧光探针负载 |
| 3.4.2 小鼠海马组织细胞内Ca~(2+)水平测定结果 |
| 3.5 小鼠海马组织相关酶活测定结果 |
| 3.5.1 小鼠海马Na~+-K~+-ATP酶活力测定结果 |
| 3.5.2 小鼠海马Ca~(2+)-ATP酶活力测定结果 |
| 3.6 小鼠脑海马细胞Cav1.2、NCS-1、PMCA、ATP2A2、IP3R m RNA表达测定结果 |
| 3.6.1 小鼠脑海马细胞L型钙离子通道Cav1.2 m RNA表达水平测定结果 |
| 3.6.2 小鼠脑海马细胞NCS-1和PMCA m RNA表达水平测定结果 |
| 3.6.3 小鼠脑海马细胞IP3R和 ATP2A2 m RNA表达水平测定结果 |
| 3.7 小鼠脑海马细胞Cav1.2、NCS-1、PMCA、SERCA2、IP3R蛋白水平测定结果 |
| 3.7.1 小鼠脑海马细胞L型钙离子通道Cav1.2蛋白表达水平测定结果 |
| 3.7.2 小鼠脑海马细胞NCS-1和PMCA蛋白表达水平测定结果 |
| 3.7.3 小鼠脑海马细胞IP3R和 SERCA2 蛋白表达水平测定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
四、氟对大鼠骨ROS和RNA含量的影响（论文参考文献）
- [1]六味地黄丸对H2O2致MC3T3-E1细胞氧化损伤的保护机制研究[D]. 李莉. 福建中医药大学, 2021(09)
- [2]晚期氧化蛋白产物影响骨细胞硬骨素表达参与增龄性骨量丢失的作用与机制[D]. 曾纪焕. 南方医科大学, 2021(02)
- [3]NRH：醌氧化还原酶2介导慢性氟中毒大鼠脑组织氧化应激损伤及自噬功能改变的机制研究[D]. 冉龙艳. 贵州医科大学, 2021(02)
- [4]不同钙水平下氟暴露致肾脏损伤作用及机制[D]. 唐乐. 浙江师范大学, 2021(02)
- [5]氟化物对发育性髋关节发育不良发病易感性的影响及其作用机制的研究[D]. 周维政. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]蕨麻黄酮对镉氧化毒性介导骨质疏松症的干预作用及其机制研究[D]. 刘迪. 兰州大学, 2020(01)
- [7]氟对骨细胞调控成骨作用的研究[D]. 蒋宁宁. 吉林大学, 2020(08)
- [8]基于转录组学和蛋白质组学的小鼠氟中毒脑损伤研究[D]. 罗永珍. 西北师范大学, 2020(01)
- [9]燃煤型氟中毒雌性大鼠雌激素变化对骨代谢及骨微结构的影响[D]. 杨兰. 贵州医科大学, 2020(04)
- [10]氟暴露下小鼠脑海马钙稳态变化分子机制的研究[D]. 邵丹丹. 浙江师范大学, 2020(01)