黄单胞菌HarpinX蛋白耐热机制的初步研究

论文摘要

Harpin蛋白是由hrp基因编码的抗病激活蛋白,也是一种耐热蛋白,通过革兰氏阴性植物病原细菌Ⅲ型泌出系统（Type Ⅲ secretion system,T3SS）分泌,既能诱导非寄主植物产生过敏性坏死反应（Hypersensitive response,HR）,同时其本身又是病原菌的一种致病因子。目前国内外对Harpin蛋白的作用机制已有深入研究,但对于它的耐热机制尚未见专门的研究报道。为了研究HarpinX的耐热机制,本研究以来自黄单胞菌的HpaXm、Hpa1Xoo、HpaXam和HpaXcm为材料,利用生物信息学技术深入分析了蛋白结构特征;通过烟草叶片表型试验和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术,从表观和微观两方面探索了高温对蛋白功能的影响;通过检测蛋白吸光度和圆二色（Circular dichroism,CD）光谱,探究了高温对蛋白结构的影响:利用定点突变技术对蛋白coiled-coil（CC）结构进行改造,验证了 CC结构与蛋白热稳定性的关系。主要研究结果如下:1.通过烟草叶片HR表型试验分析比较4种HarpinX蛋白的热稳定性,发现高温对Hpa1Xoo和HpaXcm的HR活性影响不明显,说明热稳定性较好;高温使得HpaXm和HpaXam的HR活性明显下降,说明热稳定性较差。2.通过检测蛋白吸光度,发现HarpinX吸光度随处理温度的增加而上升,推测高温使包埋在结构内部的苯丙氨酸逐渐暴露,蛋白结构逐渐展开。通过CD光谱检测二级结构含量,发现高温处理后HarpinX的α-螺旋含量增加至接近100%。进一步证实高温使HarpinX的蛋白结构发生变化,促进其他二级结构向α-螺旋转化。3.通过表型试验发现,HarpinX的HR活性随高温变化不明显。利用qRT-PCR对NtEXP6、Hin1、HSR203J、NPR1、PR-1a表达情况进行检测,发现高温使各基因表达量发生了不同程度的变化。推测HarpinX的耐热性与蛋白空间结构关系微弱,但蛋白诱导基因表达的能力与蛋白空间结构关系密切。4.利用生物信息学对蛋白进行分析,发现在HarpinX蛋白N末端的α-螺旋区域都能够形成CC结构,但形成的可能性各有不同。利用定点突变技术改造CC结构,成功获得突变体 HpaXmAL39A、HpaXmAD40A、Hpa1XooAL40A、Hpa1Xoo△D41A、HpaXam△L44A、HpaXamAM54L、HpaXcmAL40A 和 HpaXcmAD41A。通过 Western blot发现,HpaXam的Leu44对蛋白可溶性表达至关重要。结合CC结构预测结果发现,若破坏CC的形成,相应突变体的热稳定性随之变弱;反之,若加强CC的形成,相应突变体的热稳定性随之增强。5.综合以上结果推测,高温使HarpinX的空间结构逐渐展开,但蛋白的HR活性具有耐热性,可能是由于高温无法破坏蛋白的氨基酸序列,所以序列中heptad的关键氨基酸仍能够通过疏水作用力形成CC结构,因此高温处理后的HarpinX蛋白仍然能与烟草叶片中的互作蛋白进行互作,从而产生HR坏死斑。对HarpinX蛋白的耐热机制进行初探,不仅为深入研究Harpin蛋白的作用机理奠定基础,也为改造工业上非耐热蛋白提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
•   1.1 Harpin蛋白的研究进展
•     1.1.1 Harpin蛋白的概述及其分类
•     1.1.2 Harpin蛋白的有益效应及其作用机制研究
•     1.1.3 Harpin蛋白在植物上的信号通路研究
•   1.2 蛋白耐热机制的研究进展
•     1.2.1 蛋白耐热机制的研究
•     1.2.2 Harpin蛋白耐热机制的相关研究
•   1.3 Coiled-coil结构及其研究进展
•     1.3.1 Coiled-coil结构概述
•     1.3.2 Coiled-coil结构的应用
•   1.4 圆二色光谱的原理及其应用
•     1.4.1 圆二色光谱的原理
•     1.4.2 圆二色光谱在Harpin上的应用
•   1.5 本研究的目的意义与技术路线
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 供试植物
•     2.1.2 菌株及载体
•     2.1.3 酶、生化试剂和试剂盒
•     2.1.4 主要实验仪器
•     2.1.5 供试培养基
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 基因的克隆及其表达载体的构建
•     2.2.2 蛋白及其突变体的诱导表达及鉴定
•     2.2.3 蛋白的纯化与酶切
•     2.2.4 蛋白及其突变体的HR活性检测
•     2.2.5 实时荧光定量PCR
•     2.2.6 UV法检测蛋白吸光度
•     2.2.7 圆二色光谱的检测
•     2.2.8 定点突变
•     2.2.9 生物信息学分析
•     2.2.10 数据统计与处理
• 3 结果与分析
•   3.1 HarpinX蛋白序列同源性分析和结构预测
•     3.1.1 同源Harpin蛋白的氨基酸序列比对
•     3.1.2 同源Harpin蛋白序列聚类分析和保守基序预测
•     3.1.3 HarpinX蛋白二级结构预测以及可溶性分析
•     3.1.4 HarpinX的CC结构预测
•     3.1.5 HarpinX蛋白的三级结构预测
•   3.2 HarpinX蛋白的表达、纯化及其热稳定性分析
•     3.2.1 pGEX-6P-1表达载体的构建
•     3.2.2 GST-HarpinX融合蛋白的诱导与表达
•     3.2.3 HarpinX的纯化与酶切
•     3.2.4 高温对HarpinX蛋白HR活性的影响
•     3.2.5 高温对HarpinX诱导相关基因表达的影响
•     3.2.6 高温处理后HarpinX蛋白吸光度变化
•     3.2.7 HarpinX的二级结构分析以及高温对二级结构含量的影响
•   3.3 HarpinX突变体蛋白的热稳定性评价及其机理分析
•     3.3.1 突变体蛋白CC结构预测及密码子偏好性
•     3.3.2 HarpinX突变体蛋白的表达
•     3.3.3 突变体蛋白HR活性及其耐热性
• 4 讨论
•   4.1 HarpinX蛋白序列同源性分析和结构预测
•     4.1.1 4种HarpinX蛋白的进化关系
•     4.1.2 HarpinX蛋白的结构分析
•   4.2 HarpinX蛋白的热稳定性分析
•     4.2.1 高温对HarpinX的HR活性影响
•     4.2.2 高温对HarpinX诱导相关基因表达的影响
•     4.2.3 高温处理后HarpinX蛋白吸光度变化
•     4.2.4 高温对HarpinX二级结构含量的影响
•   4.3 HarpinX突变体蛋白的热稳定性评价及其机理分析
•     4.3.1 突变位点的筛选
•     4.3.2 突变位点对HarpinX蛋白表达及功能的影响
•     4.3.3 HarpinX蛋白热稳定性的机理分析
• 5 结论
•   5.1 比较了HpaXm、Hpa1Xoo、HpaXam和HpaXcm的热稳定性
•   5.2 证实了高温能够改变HarpinX的空间结构
•   5.3 探究了HarpinX蛋白功能与蛋白空间结构之间的关系
•   5.4 证明了HarpinX蛋白的热稳定性与CC结构有关
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周晓韵

导师: 缪卫国

关键词: 热稳定性,过敏性反应,实时荧光定量,圆二色光谱,定点突变,结构

来源: 海南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 海南大学

分类号: S432.42

DOI: 10.27073/d.cnki.ghadu.2019.000328

总页数: 81

文件大小: 6698K

下载量: 33