定量蛋白质组学揭示hfq2在嗜水气单胞菌多效生理功能中的重要作用

论文摘要

Hfq蛋白是一种进化上高度保守的sRNA分子伴侣蛋白,可在转录后水平调控RNA翻译并在细菌生理功能调节中发挥重要作用。大多数细菌基因组只有一个hfq拷贝,然而少数细菌在其染色体上含有两个甚至多个hfq拷贝。目前对Hfq蛋白的分子机制理论大多是建立在常见的Hfq蛋白（Hfq1）上,而Hfq2蛋白由于在大肠杆菌等模式生物中不存在,其聚体形成模式与功能的研究较为缺乏。据以往报道,不同细菌不同hfq拷贝的生理功能具有多样性,且与Hfq1相比Hfq2的同源性具有较大差异,这提示Hfq2蛋白的功能与调控机制在不同微生物中可能会有所不同,其作用在很大程度上仍然不清楚,有待进一步的研究。本实验室前期对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）ATCC 7966（NC008570.1）的全基因组分析发现该菌基因组中含有两个hfq拷贝,一个是常见的hfq,其基因名是AHA0924,与大多数细菌Hfq有着较高的同源性,其生物学功能研究较为清楚;另一个hfq拷贝,本文将其简称为hfq2,其基因名是AHA3797,是一个含有121个残基（13.3 kDa）的Sm家族RNA分子伴侣蛋白,目前尚未见对嗜水气单胞菌Hfq2蛋白生物学功能的研究报道。本论文对嗜水气单胞菌Hfq1和Hfq2蛋白的结构域进行分析,发现嗜水气单胞菌Hfq2与模式菌株大肠杆菌Hfq一样,含有两个保守的区域。同源性分析发现Hfq2与Hfq1和大肠杆菌Hfq的同源性均为50%,而Hfq1与大肠杆菌Hfq的同源性为87%,提示Hfq2蛋白可能与常见的Hfq蛋白的生物学功能不同。为研究hfq2对嗜水气单胞菌生理功能的影响,本论文利用同源重组技术成功构建嗜水气单胞菌ATCC 7966（35）hfq2敲除菌株,并对其生理表型进行测定。结果发现,与野生型菌株相比,当hfq2基因缺失以后生长情况不受影响,说明hfq2基因不是嗜水气单胞菌生长所必需的基因;但是hfq2基因缺失以后可以显著提高胞外蛋白酶（ECPase）活性、趋化性、涌动能力;在低温、酸性和碱性环境下具有更强的耐受性;对多粘菌素B和硫酸粘杆菌素的敏感性显著提高,对硫酸新霉素稍微敏感;此外还对较高温（42℃）和H2O2应激胁迫更敏感,且生物被膜的形成能力显著降低;然而溶血能力却没有受到影响,说明Hfq2在调控嗜水气单胞菌的多种基本生理功能中发挥重要作用,具有多效性。为深入研究hfq2基因缺失后对嗜水气单胞菌在浮游状态和生物被膜状态下对细菌蛋白表达的影响,本论文进一步利用基于SWATH的定量蛋白质组学技术分别比较这两种状态下Δhfq2与野生菌株之间的蛋白表达差异。首先,本论文利用定量蛋白质组学技术比较嗜水气单胞菌Δhfq2突变株和野生型菌株在浮游状态下蛋白表达差异,共鉴定到862个蛋白,其中有234个蛋白表达上调,72个蛋白表达下调,差异蛋白占总鉴定蛋白数的35.49%。生物信息学分析发现,hfq2缺失菌中与次生代谢产生的生物合成、三羧酸循环（TCA循环）、碳代谢、丙酸代谢等中心代谢途径相关蛋白表达显著上调,而核糖体亚基等翻译相关蛋白表达下调。此外,研究还发现,hfq2的缺失导致Hfq、Crp等DNA或RNA结合蛋白表达上调,而双组分调节系统调节因子OmpR则表达下调,说明Hfq2蛋白可能在嗜水气单胞菌的多个重要生物学过程及基本生理功能在起重要的调节作用。本论文随后通过q-PCR和Western blotting印迹方法验证部分差异蛋白质的表达量,证实q-PCR和Western blotting结果与定量蛋白质组学数据结论基本一致。其次,本论文进一步利用定量蛋白质组学技术比较嗜水气单胞菌Δhfq2突变株和野生型菌株在生物被膜状态下的蛋白表达差异,结果共鉴定到1538个蛋白,其中131个蛋白表达上调,140个蛋白表达下调,差异蛋白占总鉴定蛋白数的17.6%。生物信息学分析发现,hfq2基因缺失导致细菌铁离子转运相关蛋白表达大幅上调,趋化作用相关蛋白则大幅下调,而hfq2的缺失没有引起其同源蛋白Hfq1表达量的显著变化,提示两个Hfq同源蛋白在嗜水气单胞菌生物被膜形成过程中的作用可能不同。为进一步验证铁离子在Hfq2介导的生物被膜形成过程中的作用,本论文通过铁离子螯合剂添加试验证实Hfq2蛋白可能通过影响铁离子动态平衡过程相关蛋白的表达来影响细菌生物被膜的形成,并通过q-PCR和Western blotting印迹进一步验证部分差异蛋白质的表达量,表明此次蛋白质组学结果可靠。综上所述,本论文首次在蛋白质水平上研究嗜水气单胞菌hfq2基因的生理功能,表明该基因不是假基因,且在细菌生理功能中发挥重要的调节作用。本文对Hfq2的功能研究,将有助于进一步完善嗜水气单胞菌的抗逆性机理,为有效预防和控制该致病菌提供靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
•   1.1 嗜水气单胞菌的危害
•   1.2 Hfq蛋白的结构功能与国内外研究进展
•     1.2.1 Hfq蛋白的发现
•     1.2.2 Hfq蛋白的结构
•     1.2.3 Hfq蛋白的功能
•     1.2.4 Hfq蛋白的研究意义
•   1.3 Hfq2 蛋白的结构功能与国内外研究进展
•     1.3.1 Hfq2 蛋白的发现
•     1.3.2 炭疽芽孢杆菌的Hfq同源蛋白的研究进展
•     1.3.3 伯克霍尔德氏菌属Hfq同源蛋白的研究进展
•     1.3.4 嗜水气单胞菌Hfq同源蛋白的研究进展
•   1.4 本论文主要研究内容及其研究意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 实验动物
•     2.1.3 主要试剂来源
•     2.1.4 主要仪器
•     2.1.5 常用试验试剂配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 不同细菌Hfq蛋白同源性比较
•     2.2.2 嗜水气单胞菌pET-32a-Hfq2 高表达菌株的构建
•     2.2.3 Hfq2 蛋白的纯化与蛋白浓度测定
•     2.2.4 Hfq2 鼠抗的制备
•     2.2.5 嗜水气单胞菌Δhfq2 突变株的构建
•     2.2.6 嗜水气单胞菌Δhfq2 突变株生长速率的测定
•     2.2.7 运动性
•     2.2.8 胞外蛋白酶活性与溶血活性的测定
•     2.2.9 生物膜的测定
•     2.2.10 体外应激实验
•     2.2.11 药物敏感实验
•     2.2.12 细菌全蛋白的提取
•     2.2.13 质谱鉴定
•     2.2.14 Western Boltting分析
•     2.2.15 荧光定量PCR
• 第三章 结果与分析
•   3.1 不同细菌Hfq蛋白同源性分析
•   3.2 hfq2 基因克隆表达与纯化
•     3.2.1 原核表达载体构建及鉴定
•     3.2.2 重组工程菌诱导表达产物的SDS-PAGE分析
•     3.2.3 Hfq2 蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析
•     3.2.4 讨论
•   3.3 Δhfq2 突变株与野生菌生物学特性比较
•     3.3.1 嗜水气单胞菌Δhfq2 突变株的构建
•     3.3.2 Δhfq2 对嗜水气单胞菌生长情况的影响
•     3.3.3 Δhfq2 对嗜水气单胞菌运动性的影响
•     3.3.5 Δhfq2 对嗜水气单胞菌胞外蛋白酶活性与溶血性的影响
•     3.3.6 Δhfq2 对嗜水气单胞菌生物膜的影响
•     3.3.7 Δhfq2 对嗜水气单胞菌在氧化、高低温、酸碱性环境和高渗透压下的耐受性
•     3.3.8 Δhfq2 对嗜水气单胞菌一些药物的敏感性分析
•     3.3.9 讨论
•   3.4 浮游状态下野生菌与Δhfq2 突变株定量蛋白质组学研究
•     3.4.1 浮游状态下野生菌与突变株的定量蛋白质组学比较
•     3.4.2 差异蛋白功能分类及注释分析
•     3.4.3 差异蛋白的KEGG途径分析
•     3.4.4 蛋白质组学数据验证
•     3.4.5 讨论
•   3.5 生物膜状态下野生菌与Δhfq2 突变株定量蛋白质组学研究
•     3.5.1 生物膜状态下野生菌与突变株的定量蛋白质组学比较
•     3.5.2 生物信息学分析
•     3.5.3 蛋白质组学验证
•     3.5.4 讨论
• 第四章 总结与展望
•   4.1 总结
•   4.2 展望
• 参考文献
• 硕士研究生期间发表的文章
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 蔡奇岚

导师: 林向民

关键词: 嗜水气单胞菌,定量蛋白质组学,生物被膜

来源: 福建农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 福建农林大学

基金: 国家自然科学基金(31670129)

分类号: Q936

总页数: 88

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