郑姣宁宁(通讯作者)
(湖南省人民医院科研办<湖南师范大学第一附属医院科研办>湖南长沙410005)
【摘要】目的：研究甘草甜素(glycyrrhizin)体外对细胞色素P450酶亚型CYP1A2活性的影响。方法：以咖啡因为探针药，采用高效液相色谱法测定探针药与相应代谢产物的浓度，研究甘草甜素在人肝微粒体孵化体系和重组酶体系中对CYP1A2活性的影响。结果：在人肝微粒体反应体系中，0.1，0.2，0.4，0.8mmol?L-1甘草甜素使咖啡因的代谢产物的生成分别降低了31±15％(p=0.007)、43±8％(p=0.012)、48±6％(p=0.037)、49±4％(p=0.029)；在体外重组酶反应体系中，0.1，0.4mmol?L-1甘草甜素使咖啡因的代谢产物的生成分别降低了48±9％(p=0.012)、82±8％(p=0.004)。结论：甘草甜素对CYP1A2酶体外活性有较明显的抑制作用;随着甘草甜素浓度的增高，抑制作用也相应增强。
【关键词】甘草甜素肝微粒体重组酶CYP1A2
【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2014）11-0273-02
【Abstract】Objective:ToinvestigatetheeffectofglycyrrhizinonCYP1A2activityinvitro.Method:Caffeine(aCYP1A2substrate)wasusedasprobe.TheconcentrationsoftheprobedruganditsmetaboliteweredeterminedbyHPLC.TheeffectofglycyrrhizinonactivityofCYP1A2wasdetectedthroughhumanmicrosomesandrecombinantenzymereactionsysteminvitro.Results:GlycyrrhizininhibitedtheactivityofCYP1A2invitro.Inhumanlivermicrosome,0.1mM,0.2mM,0.4mM,0.8mMglycyrrhizindecreasedtheactivitiesofCYP1A2by31±15％(p=0.007),43±8％(p=0.012),48±6％(p=0.037),49±4％respectively.Inrecombinantenzymereactionsystem,0.1mM,0.4mM,glycyrrhizindecreasedtheactivitiesofCYP1A2by48±9％(p=0.012)、82±8％(p=0.004).Conclusion:GlycyrrhizininhibitedtheactivityofCYP1A2inadose-dependentfashioninvitro.
【Keywords】glycyrrhizinhumanmicrosomesrecombinantenzymecytochrome1A2
甘草甜素是从甘草中分离得到的三萜类成分,又称甘草酸(glycyrrhezicacid)，分子式为C42H62O16。以甘草甜素为主要成分的制剂如复方甘草甜素片，复方甘草甜素注射剂等由于具有抗病毒、抗肿瘤，免疫调节，类糖皮质激素及清除氧自由基等明确的药理作用，因而在临床上用于急性、慢性肝炎、湿疹、荨麻疹及过敏性皮肤病、药物疹和嗜酸性粒细胞增多症等疾病的辅助治疗[1]。甘草甜素的副作用较少，常见副反应主要是低血钾和高血压等假醛固醇增多症。由于甘草甜素各类制剂作为辅佐用药，应用广泛、用药时间较长，甘草甜素与其他药物合用的机会相当常见。不良药物作用相应增多，例如：甘草甜素与降压药、利尿剂和降血糖药合用可使相应症状加重，与水合氯醛联用，可拮抗其镇静和催眠作用,诱发洋地黄中毒[2]。近年有研究表明甘草甜素对于大鼠CYP450s有明显的影响[3]，为探讨甘草甜素对人类药物代谢酶的影响，明确该药与其他药物相互作用的理论基础，本研究以咖啡因为探针药，采用高效液相色谱法测定探针药与相应代谢产物的浓度，在体外研究人肝微粒体反应体系和人重组酶反应体系中甘草甜素对CYP1A2酶活性的影响。
1材料和方法
1.1药品与试剂
咖啡因（137X）、1，7-二甲基黄嘌呤（17X）、β-羟基乙基茶碱（HT）、甘草甜素、小牛血清白蛋白、重组酶CYP1A2、葡萄糖－6－磷酸（G－6－P）、葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G－6－PDH）、辅酶II（β-NADP）购自Sigma公司(St.Louis,Mo,US)。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
1.2仪器
PCR仪（PerkinElmerCetus,USA）,电泳仪（北京六一仪器厂），紫外凝胶成像系统(美国上岛公司),恒温水浴箱（HetoHoltenDenmark）,岛津2010高效液相色谱仪，匹配紫外检测器，荧光检测器，安吉能2100高效液相色谱仪，匹配紫外检测器，色谱柱为5umHpersilC18柱(4.6mm×250mm)，5umDiamonsilC18柱(4.6mm×250mm)，HibarRT柱(4.6mm×150mm)。
1.3试验方法
1.3.1肝脏标本的收集及肝微粒体的制备
本研究经湖南省人民医院伦理委员会批准。本研究采用的肝脏标本取自中国汉族成人个体，均为肝脏手术切除的正常组织。患者均为肝内胆管结石需手术治疗病人，且无急慢性肝炎及明显肝硬化，肝功能检查正常，亦未在术前两周内服用过CYP450的诱导剂或抑制剂。肝脏标本在离体1小时内置于冰生理盐水中并切成小片，以0.9％冰生理盐水漂洗后置液氮速冻，然后转入-80℃的冰箱中保存备用。
人肝微粒体的制备采用采用差速离心法[4]，所有操作均在4℃进行。微粒体蛋白浓度以Lowry法并用小牛血清白蛋白作标准对照测定[5]。制备好的肝微粒体分装后于-80℃的冰箱中保存备用。
1.3.2孵育反应
100mmol.L-1K2HPO4-KH2PO4(PH=7.4)的缓冲溶液反应体系（总体积为480μl）中加入0.5mg肝微粒体（终浓度为0.5mg/ml）或重组酶（终浓度为0.5mg/ml）、2.5μmol的MgCl2、0.5μmol的β-NADP、0.05μmol的EDTA、5μmol的G－6－P和药物，37℃摇动水浴中预孵化5分钟，加入0.5IU的G－6－PDH（20μl），孵化。
孵化反应分对照组和试验组进行，对照组的药物为分别为20μl咖啡因（100μmol.L-1），试验组则为6组20μl不同浓度甘草甜素(0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8mmol.L-1)加探针药[5]。每组平行做三份。
1.3.3酶活性测定
酶活性：以咖啡因的代谢产物的产率（nmolepermgmicrosomalproteinperhour）作为酶活性指标。
1.3.4样品处理及色谱条件
CYP1A2[6]：孵化1小时，冰浴冷却终止反应，加入20μlβ-羟基乙基茶碱（14.28μg.ml-1）作为内标，用5ml氯仿:异丙醇（9:1）萃取，涡流混合1分钟，离心8分钟（1800转/分钟），分离有机层，用低于40℃高纯度氮气吹干，用100μl流动相溶解残留物，20μl进样。HPLC系统包括岛津LC-2010CHT，采用5umHpersilC18柱(4.6mm×250mm)，柱温40℃，流动相为乙腈:水相（0.05%醋酸）=12:88,流速为1.0ml.min-1，检测波长为282nm。
1.3.5线性范围及最小检出浓度
用空白磷酸钾缓冲溶液将标准储备液稀释成不同浓度的混合液，按样品处理方法，得到：17X线性范围为19.53～10000ng/ml,直线回归方程为Y＝1685.14X-48.1353,决定系数（r2）为0.9996，最小检出浓度为4.85ng/ml。
1.4统计分析
运用SPSS11.0软件进行数据的分析。所有的数据均以均数±标准差表示。体外实验用配对T检验分析两组间各酶的活性差异。P<0.05被认为有统计学意义。
2结果
2.1肝微粒体反应体系实验结果
经配对t检验，在肝微粒体孵育体系中，0.025,0.05，0.1，0.2，0.4,0.8mmol?L-1甘草甜素使咖啡因的代谢产物的生成分别降低了19±18％(p=0.192)、25±16％(p=0.166)、31±15％(p=0.007)、43±8％(p=0.012)、48±6％(p=0.037)、49±4％(p=0.029),表明0.1mmol?L-1及以上浓度甘草甜素对CYP1A2的活性影响与未加甘草甜素组有统计学差异，提示相应浓度甘草甜素对CYP1A2的活性有抑制作用，且随着甘草甜素浓度升高，对CYP1A2活性的抑制程度也逐步增强。
表1人肝微粒体孵育体系中加入不同浓度葛根素和未加葛根素组咖啡因代谢产物产率比较的统计分析(n=3，x-±s)
*p﹤0.05有统计学意义
2.2重组酶反应体系实验结果
重组酶孵育体系中加人不同浓度甘草甜素和未加甘草甜素组各探针药的代谢产物的产率见表2，经配对t检验，在重组酶孵育体系中，0.1，0.4mmol?L-1甘草甜素使咖啡因的代谢产物的生成分别降低了48±9％(p=0.012)、82±8％(p=0.004),表明相应浓度甘草甜素对CYP1A2的活性影响与未加甘草甜素组有统计学差异，提示相应浓度甘草甜素对CYP1A2的活性有抑制作用，且浓度较高组，抑制程度较强。
表2重组酶孵育体系中加入不同浓度的葛根素和未加葛根素组咖啡因代谢产物的产率比较的统计分析(n=3,x-±s)
*p﹤0.05有统计学意义
3讨论
药物对于CYP450s酶活性的影响，是导致药物相互作用的主要原因之一，CYP1A2是人体内重要的CYP450s酶亚型，多项研究表明黄酮类药物对CYP1A2活性有明显影响。研究提示甘草甜素对大鼠细胞色素CYP450s酶活性存在明确影响，人类和大鼠的细胞色素CYP450s酶有一定的同源性，但人和大鼠的细胞色素CYP450s酶的种类活性并非完全一致[7]，本研究在自行制备的人肝微粒体孵育体系和购买的稳定重组酶体系中得到较一致的结论，即甘草甜素对人CYP1A2的活性有抑制作用，且随着甘草甜素浓度的升高，抑制效应进一步增强。
然而，黄酮类药物对CYP450s酶活性的影响在体内和体外可能存在双重性表现[8]，如茶多酚在体外对肝微粒体中的CYP450s酶都表现出抑制效应，但在大鼠体内试验却证实长期摄入能提高CYP1A2的活性。本研究结果在探索甘草甜素对人类CYP450s酶影响的方面中有重要的意义，但甘草甜素对于患者体内CYP1A2酶活性的影响还有待进一步的研究，其效应可能与体外研究一致，也有可能出现相反的结果，有待进一步的研究和证实。
总之，本研究结果表明，甘草甜素在体外对CYP1A2的活性有抑制作用。且随着甘草甜素浓度的升高，其对人肝微粒体孵育体系和重组酶体系中CYP1A2。
活性的抑制作用加强。CYP1A2参与临床上多种药物如华法林钠，普萘洛尔，维拉帕米，硝苯地平等多种药物的代谢。因此在临床治疗中，甘草甜素和CYP1A2代谢的药物合用时，应该注意药物相互作用发生的可能，尤其值得关注的是哪些治疗指数较窄的药物，以减少药物不良反应，达到合理用药的目的。
参考文献
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