基于ESIPT和AIE探针的活细胞和脂滴实时荧光成像研究

论文摘要

聚集诱导发光（Aggregation-induced emission,AIE）这一概念自2001年被提出以来,对有机发光材料和生物医学等领域产生了重大且深远的影响。聚集诱导发光试剂（AIE Luminogens,AIEgens）作为一种具有高稳定性、高可见度的光学成像探针,已在精准定位生物成像、胞内物质测定、动态过程实时监控、药物可视化传输等众多领域展现出广阔的应用前景。其中,AIEgens精准的亚细胞结构定位能力是一项重要的基础性研究,对其在生物医学成像领域的广泛应用发挥了不可替代的作用。线粒体、溶酶体、细胞膜、脂滴等亚细胞结构的特异性染色和点亮的AIEgens的特征和规律总结,为指导特定功能分子探针的设计和丰富分子载体材料的选择提供了重要的参考价值。近年来功能性AIEgens的报道层出不穷,进一步拓展了其在生物成像分析领域的应用范围,因此系统性地研究这些新兴AIEgens的成像性质和定位能力是必要且重要的。其中激发态分子内质子转移（Excited-state intramolecular proton transfer,ESIPT）荧光功能分子的细胞成像性能研究、天然药物分子的AIE性质研究和成像应用、兼具优异发光性能和精准定位能力的AIEgens的开发和成像应用,都具有较高的研究价值且被广泛关注。然而这些方面的研究工作尚处于起步阶段,并且存在一些噬待解决的问题。首先,ESIPT类AIEgens的质子转移核心结构需要完好地保留,因此对其进行结构改性往往仅限于从取代基部位着手,如此一来对整体分子的发光性能和成像性能难以做到多方位高效调控。其次,将天然药物的AIE性能优势用于其细胞内分布和药物作用过程的成像研究,则需要完美地契合药物的发光条件和药物分布及作用位点的生理环境,故而研究模型的建立需遵从药物的客观属性。再者,具有AIE性质的天然药物分子种类鲜有报道,且性能固定难以有效调控,所以针对性地设计和筛选发光性能优异的精准定位成像探针仍是迫切需要的。发光性能能够可控调节的智能型分子显然将会备受欢迎,但是开发难度较大。上述问题显然会给研究者带来分子设计和成像应用等方面的更高要求。本论文围绕上述的研究难点和问题,借鉴前人的研究工作基础,在具有高效跨膜成像性能的ESIPT类AIEgens的筛选和成像应用、天然药物盐酸小檗碱的AIE性质用于脂滴的实时原位荧光成像和降脂作用研究、以及兼具刺激响应接口和精准脂滴定位能力的AIEgens的设计和细胞脂滴成像应用研究等方面开展了如下具体的工作:1.高跨膜性能ESIPT类AIEgen的制备和细胞成像应用选定水杨醛和对二甲氨基苯胺通过醛胺缩合反应制备的席夫碱作为ESIPT类系列分子的母核结构。固定其中的二甲氨基苯胺,采用具有不同取代基的水杨醛分子来构建含有不同取代基的4-N,N-二甲基氨基苯胺水杨醛席夫碱（4-N,N-dimethylaminoaniline salicylaldehyde Schiff-bases,DSS）系列分子。四种细胞系成像考察结果证实二乙胺基功能化的DSS分子（DSS-4-DEA）较之于其他四种同系列分子具有显著优异的细胞穿透能力,能够有效地跨过细胞膜进入并点亮细胞。质子转移核心结构中具有近距离空间排布的羟基氧和亚胺氮原子,可以与多种金属离子配位,考察结果表明DSS系列分子均具有铜离子识别特性,表现出铜离子猝灭的荧光信号响应。DSS-4-DEA从而可以用于铜离子的定量检测和细胞成像传感。此外,DSS-4-DEA能够用作高效的跨膜载体显著提升细胞穿透力低的DSS-5-Br分子和强疏水药物姜黄素的细胞内递送,实现双色成像和增强的抗癌活性,证实了DSS-4-DEA的多功能应用。2.脂代谢干预中盐酸小檗碱的AIE实时成像研究选定具有AIE性质的不同阴离子的小檗碱（Berberine,BBR）系列分子,考查其AIE性质。AIE曲线显示,阴离子引起的BBR溶解性的差异对发光强度起到调节作用,结果表现为水溶性差的硫酸小檗碱（Berberine sulfate,BBR-HSO4）具有较之于BBR和盐酸小檗碱（Berberine hydrochloride,BBR-Cl）更强的荧光。但三者的发光强度均可以满足荧光成像要求,故而选择临床最为常用的BBR-Cl作为后续的降脂调控作用的成像研究。构建诱导形成3T3脂肪细胞模型以及油酸喂养形成的HeLa细胞模型,将BBR-Cl用作降脂药物来研究两种细胞的脂肪代谢的调节。借助BBR-Cl在脂肪环境中特定的富集及其在脂滴中聚集状态下发出绿色荧光,系统地研究7.5?M的BBR-Cl自身在细胞内分布和代谢速率,及其脂代谢干预中脂滴含量的动态变化过程的实时成像分析。实时成像分析结果与油红O固定染色法结果基本吻合,充分体现了BBR-Cl的降脂治疗和荧光探针的双功能应用。3.脂滴定位AIEgen TPA-CN的制备和高灵敏成像研究依据脂滴定位AIEgens的结构规律和设计原则,通过选用可外界刺激响应的亚胺键作为连接节点,构建兼具刺激应答性能和脂滴定位性能的AIEgen。其中电子供受体对分别选用三苯胺和苯甲腈结构,则制备的TPA-CN分子较之于三苯胺-醛基结构具有红移的发光波长。该席夫碱结构具有一定的稳定性,对低于pH 4.35的酸度有响应,光谱研究结果表现为酸性条件下发光波长从530 nm到480 nm的蓝移,原因归结为酸触发的断键引起的共轭结构减小。采用商用的红色荧光脂滴染料尼罗红与TPA-CN进行共定位成像研究,结果表明TPA-CN具有高效的脂滴定位成像能力,且对小粒径脂滴的成像可见度更高。高的光稳定性和信背比使得TPA-CN可以用于细胞内脂滴的高灵敏成像观察,并且可用于脂滴的亚微米动态位置信息的精准获取。总之,本论文探索性地对具有DSS核心结构的系列ESIPT分子的细胞穿透成像能力进行了考察和研究,筛选出的DSS-4-DEA可以用于细胞内铜离子的荧光传感,同时作为跨膜载体实现荧光染料和药物的高效运载。合理利用BBR-Cl的绿色荧光实现了其同时作为药物分子和成像剂,在无外加荧光指示剂的情况下可视化成像观察了BBR-Cl对脂代谢干预过程的调控。此外,制备了刺激响应型的AIEgen TPA-CN,具有酸触发的荧光波长蓝移性质,并成功用作脂滴的精准定位以及高灵敏动态成像分析工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 选题依据及研究内容
•   1.1 研究意义
•   1.2 研究现状
•     1.2.1 聚集诱导发光
•     1.2.2 AIE生物成像和传感应用
•     1.2.3 AIE的精准定位成像
•     1.2.4 激发态分子内质子转移
•     1.2.5 天然药物分子的AIE性质
•     1.2.6 存在的主要问题
•   1.3 研究内容和拟解决的关键问题
•     1.3.1 研究目的
•     1.3.2 研究内容
•     1.3.3 拟解决的关键问题
•     1.3.4 研究思路
•     1.3.5 技术和研究手段
• 第2章 高跨膜性能ESIPT类 AIEgen的制备和细胞成像应用
•   2.1 引言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 仪器
•     2.2.2 主要试剂和细胞系
•     2.2.3 DSS系列ESIPT分子的制备
•     2.2.4 MTT法分析DSS系列分子的细胞毒性
•     2.2.5 DSS系列分子细胞穿透能力成像考查
• 2+的荧光分析以及选择性'>    2.2.6 Cu²⁺的荧光分析以及选择性
•     2.2.7 EDTA-2Na和 PPi介导的荧光恢复
• 2+的细胞内成像分析'>    2.2.8 Cu²⁺的细胞内成像分析
•     2.2.9 DSS-4-DEA增强的染料的细胞内化
•     2.2.10 DSS-4-DEA增强的姜黄素毒性
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 ESIPT探针细胞成像和荧光传感的方案设计
•     2.3.2 ESIPT系列探针的合成与结构表征
•     2.3.3 ESIPT系列探针的AIE性质考查
•     2.3.4 DSS系列分子细胞穿透成像考查
• 2+选择性识别与机制探讨'>    2.3.5 Cu²⁺选择性识别与机制探讨
• 2+的荧光成像分析'>    2.3.6 细胞内Cu²⁺的荧光成像分析
•     2.3.7 DSS-4-DEA增强的DSS-5-Cl的细胞内化
•     2.3.8 DSS-4-DEA增强的Cur的细胞毒性
•   2.4 结论
• 第3章 脂代谢干预中盐酸小檗碱的AIE实时成像研究
•   3.1 引言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 仪器
•     3.2.2 主要试剂和细胞系
•     3.2.3 细胞的培养
•     3.2.4 MTT法分析BBR-Cl对细胞存活率影响
•     3.2.5 油红O染色脂滴的观察及细胞内脂滴含量检测
•     3.2.6 BBR-Cl对细胞的脂代谢干预的处理
•     3.2.7 分析及统计学方法
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 小檗碱类的AIE性质
•     3.3.2 BBR-Cl对3T3-L1 脂肪细胞的脂代谢干预成像监控
•     3.3.3 BBR-Cl对 HeLa细胞油酸喂养模型的脂代谢干预成像监控
•   3.4 结论
• 第4章 脂滴定位AIEgen TPA-CN的制备和高灵敏成像研究
•   4.1 引言
•   4.2 实验部分
•     4.2.1 仪器
•     4.2.2 细胞和试剂
•     4.2.3 TPA-CN的制备和表征
•     4.2.4 TPA-CN的光学性质测定
•     4.2.5 TPA-CN的 pH响应考查和机制解析
•     4.2.6 MTT法分析TPA-CN分子对细胞存活率影响
•     4.2.7 TPA-CN的脂滴定位成像
•     4.2.8 数据处理与分析
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 TPA-CN的合成与结构表征
•     4.3.2 TPA-CN的 AIE性质
•     4.3.3 TPA-CN的 pH响应的光谱分析
•     4.3.4 TPA-CN的脂滴定位成像研究
•     4.3.5 TPA-CN用于脂滴动态信息的高灵敏成像
•   4.4 结论
• 第5章 全文总结与展望
•   5.1 全文总结
•   5.2 论文创新点
•   5.3 展望
•     5.3.1 覆盖更广的亚细胞定位探针
•     5.3.2 智能型治疗剂的开发
•     5.3.3 AIE性质天然分子库的建立
• 参考文献
• 科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李彦杰

导师: 胡昌华

关键词: 聚集诱导发光,激发态分子内质子转移,细胞穿透能力,盐酸小檗碱,脂代谢,脂滴

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 西南大学

分类号: Q-334;O657.3

总页数: 123

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