鸭肝炎强弱毒感染宿主的转录组、SOCS3相关免疫通路及细胞因子变化比较研究

论文摘要

1型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis A virus type 1,DHAV-1）是危害养鸭业的重要病原之一,弱毒疫苗CH60株是将DHAV-1 CH强毒株通过鸡胚连续传代培育而得,并广泛用于该病的免疫预防,然而强、弱毒株引起宿主产生变化的比较研究仍然较为缺乏。本研究围绕该问题展开研究并获得了以下实验结果。1.DHAV-1强弱毒感染鸡胚肝脏的转录组学测序及分析DHAV-1强毒株（CH株）和弱毒疫苗（CH60株）接种12日龄的SPF鸡胚,收集接种后12、24、36和48h的鸡胚肝脏,分析其病理学变化,并对感染48h后的鸡胚肝脏进行透射电镜观察和转录组测序与验证。结果发现,感染48h后,CH60株感染鸡胚肝脏表面有明显的瘀斑出血;组织病理学观察到大量红细胞浸润于肝窦中,肝索较为紊乱,部分肝细胞核固缩、核溶解以及核破裂。CH株感染鸡胚肝脏及组织病理学与空白组没有较大的差别。电镜观察发现,CH60株感染鸡胚的肝细胞内有大量的次级溶酶体、溶酶体残体以及吞噬了线粒体等细胞器的自噬体;大量的脂滴存在于肝细胞中,粗面内质网扩张,且围绕着大量的核糖体;线粒体有轻微的肿胀、脊断裂。而CH株感染鸡胚肝细胞中除观察到大量的糖原聚集,并无其他明显的变化。转录组测序分析发现,CH60和CH株感染鸡胚相较于空白组各自筛选出2336个和150个差异基因（以p-value<0.05和fold change>2为筛选条件）,同时两个处理组之间（CH60 vs CH）相比得到2191个差异基因。进一步的分析发现CH60株诱导肝脏产生了Ⅰ型与Ⅱ型IFN反应,而且激活了固有免疫反应,同时大量表达了抑制细胞因子信号分子1和3（suppressor of cytokine signaling,SOCS1/3）,并伴随着多条代谢通路的异常。对差异基因（SOCS1/3、STAT1/3、IRF1/7、IFNβ/γ、IL6、TLR7等）的qRT-PCR检测和SOCS3甲基化检测进一步验证了转录组数据的可靠性。2.DHAV-1对SOCS3相关免疫通路的影响转录组分析发现CH60株诱导肝脏大量表达SOCS1和SOCS3的同时,也激活了JAK-STAT信号通路,并诱导了IFN的大量表达,为探究SOCS3及其相关免疫通路与病毒复制的关系,本研究首次用DHAV-1 CH60株成功感染了鸡胚成纤维细胞（CEF）,病毒感染后36-48h增殖达到最大(108.4copies/ml);qRT-PCR检测到病毒的感染诱导了CEF内IFNα、IFNγ、SOCS3、STAT1等细胞因子的转录上调。真核过表达和shRNA干扰研究IFNs和SOCS3对DHAV-1复制的影响,结果发现,过表达SOCS3蛋白明显促进了病毒的复制,而shRNA干扰细胞内源性SOCS3分子可以抑制病毒的复制;过表达IFNα、IFNβ和IFNγ均可抑制病毒的复制;过表达SOCS3蛋白明显抑制了IFNα的转录和表达,却促进了IFNγ的转录和表达。检测SOCS3单独和与IFNs共同过表达对JAK-STAT信号通路中STAT1/3、抗病毒蛋白MX1/OASL和病毒增殖的影响,结果过表达SOCS3蛋白下调了STAT1和STAT3的转录,但同时过表达SOCS3与IFNα/γ却不能抑制STAT1与STAT3的转录,表明SOCS3不能直接通过抑制IFNα而抑制STAT1和STAT3的表达;同时过表达IFNα/γ与SOCS3比单独过表达IFNα/γ更明显抑制MX1的转录,表明SOCS3可抑制MX1的表达;SOCS3与IFNα共转染比单独转染IFNα更能促进DHAV-1的增殖。进一步对SOCS3和IFNα的亚细胞定位发现,SOCS3主要定位于胞核和胞质,而IFNα定位于胞质中,共聚焦分析两者没有明显的共定位现象,免疫共沉淀实验表明两者并不存在直接的相互作用。3.DHAV-1强、弱毒株对7日龄雏鸭肝脏和血液细胞因子变化的影响用DHAV-1 CH株和CH60株感染7日龄雏鸭,观察肝脏的病理损伤,qRT-PCR检测肝脏中病毒拷贝数、肝脏和血液中多种细胞因子的变化。结果发现,CH株(108.4copies/mg)比CH60株(104.9copies/mg)在肝脏中有更强的增殖效率;CH株造成了雏鸭肝脏表面大量的点状出血,肝细胞内有大量的红细胞浸润和坏死,TUNEL染色检测到大量的凋亡细胞,而CH60株感染雏鸭后,肝脏组织未发现明显的病理变化。同时发现,CH株引发了肝脏中IFNα、IFNβ、IL1β、IL6、IL10等显著上调的多种细胞因子风暴,并导致多种模式识别受体的表达下调,可能与病毒的免疫逃避机制相关;而CH60株成功诱导了肝脏内Ⅰ型和Ⅱ型IFN、IL6和IL10的上调表达,诱导机体产生了适度的固有免疫和细胞免疫。综上,弱毒疫苗CH60株感染鸡胚可诱导过度的炎症反应和固有免疫反应从而造成感染鸡胚肝脏的损伤、鸡胚死亡;感染CEF可通过上调表达SOCS3蛋白来抑制了FNα的表达,并通过下调STAT1和STAT3的转录,从而抑制了抗病毒蛋白MX1,最终促进了病毒的复制和增殖;免疫雏鸭可诱导产生适度的免疫反应来抵抗DHAV-1强毒攻击。强毒CH株感染引起雏鸭肝脏严重损伤的机制可能是其诱发肝脏内产生了强烈的细胞因子风暴,同时造成肝细胞内大量红细胞浸润及坏死,致雏鸭严重发病和死亡。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 部分缩写说明
• 1 文献综述
•   1.1 DHAV-1 概述
•   1.2 DHAV-1 的分子生物学
•   1.3 SOCS蛋白家族及其免疫调节功能
•     1.3.0 CIS/SOCS家族
•     1.3.1 SOCS信号通路
•     1.3.2 SOCS蛋白在病毒感染过程中的作用
•       1.3.2.1 病毒感染和免疫反应
•       1.3.2.2 肝炎病毒和SOCS蛋白
• 2 研究目的与意义
• 3 材料与方法
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 病毒、菌株、载体、雏鸭及鸡胚
•     3.1.2 PCR引物
•     3.1.4 试剂与缓冲液的配制
•       3.1.4.1 细菌培养基
•       3.1.4.2 琼脂糖凝胶电泳所需试剂
•       3.1.4.3 SDS-PAGE与 Western-blot所需试剂
•     3.1.5 实验分析软件
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 感染DHAV-1 的鸡胚肝脏的转录组学测序及分析
•       3.2.1.1 实验分组
•       3.2.1.2 HE染色、TUNEL染色和电镜观察
•       3.2.1.3 RNA分离、c DNA文库的构建和RNA测序
•       3.2.1.4 荧光定量PCR
•       3.2.1.5 基因水平定量、差异基因筛选、功能富集及聚类分析
•       3.2.1.6 甲基化特异性PCR
•     3.2.2 DHAV-1对SOCS3 相关免疫通路的影响
•       3.2.2.1 IFNα、IFNβ、IFNγ和 SOCS3 真核表达质粒的构建
•       3.2.2.2 Western Blot检测
•       3.2.2.3 间接免疫荧光检测
•       3.2.2.4 shRNA介导的SOCS3 敲低实验
•     3.2.3 DHAV-1 强弱毒株引起7 日龄雏鸭肝脏和血液内细胞因子的变化
•       3.2.3.1 实验分组
•       3.2.3.2 HE染色和TUNEL实验
•       3.2.3.3 肝脏中病毒拷贝数测定
•       3.2.3.4 细胞因子的检测
•       3.2.3.5 数据分析
• 4 实验结果
•   4.1 感染DHAV-1 的鸡胚肝脏的转录组学测序及分析
•     4.1.1 肉眼和病理学变化
•     4.1.2 超微结构和凋亡分析
•     4.1.3 转录组测序
•     4.1.4 差异基因分析
•     4.1.5 DHAV-1 介导的差异表达
•     4.1.6 差异基因的验证和SOCS3 甲基化状态的检测
•   4.2 DHAV-1对SOCS3 相关免疫通路的影响
•     4.2.1 DHAV-1在CEF细胞上的复制规律
•     4.2.2 IFNs和 SOCS3对DHAV-1 病毒复制的影响
•     4.2.3 IFNs与 SOCS3 的相互影响
•     4.2.4 SOCS3 抑制了抗病毒蛋白MX1与OASL的表达
•     4.2.5 SOCS3 抑制了STAT1和STAT3
•     4.2.6 SOCS3与IFNα的相互作用
•   4.3 DHAV-1 强弱毒株引起7 日龄雏鸭肝脏和血液内细胞因子的变化
•     4.3.1 肉眼病变观察
•     4.3.2 组织病理学和凋亡观察
•     4.3.3 肝脏中病毒拷贝数
•     4.3.4 促炎性因子、抗炎性因子及固有免疫相关因子的转录水平情况
• 5 分析及讨论
•   5.1 感染DHAV-1 的鸡胚肝脏的转录组学测序及分析
•   5.2 DHAV-1对SOCS3 相关免疫通路的影响
•   5.3 DHAV-1 强弱毒株引起7 日龄雏鸭肝脏和血液内细胞因子的变化
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 谢金炎

导师: 程安春

关键词: 型鸭肝炎病毒,蛋白,型干扰素,细胞因子,转录组测序

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000776

总页数: 55

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