菜豆环氧化物水解酶PvEH2的表达、立体选择性研究及其在手性催化中的应用

菜豆环氧化物水解酶PvEH2的表达、立体选择性研究及其在手性催化中的应用

论文摘要

手性合成一直是备受关注的热点课题。随着医药、农药及精细化工等相关领域的发展,工业上对于光学纯中间体或合成子的需求量也在不断增加。手性环氧化物和邻位二醇就是其中一类重要的高附加值合成砌块。近年来,生物催化法作为化学合成法的替代方案已显示出低成本和环境友好等优点,符合“绿色工业”和“可持续发展”的社会理念。环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH)能够立体选择性地催化外消旋(Racemic,rac-)环氧化物的开环水解,保留单一构型的环氧化物和/或生成相应的邻位二醇,被认为是一种极具潜力的生物催化剂。关于EH新酶的挖掘和应用等方面的研究工作仍然具有着重要的意义。论文从菜豆(Phaseolus vulgaris)中克隆了编码PvEH2的cDNA和基因组DNA序列,实现了PvEH2在大肠杆菌细胞内的表达;测定并分析了PvEH2针对13种单取代环氧化物的催化特性(即底物谱分析),并在此基础上通过构建新的催化反应媒介(体系),提高了代表性环氧化物底物的最高浓度;根据计算机的辅助分析,通过片段置换的方法改造PvEH2,研究cap loop区域对于PvEH2催化特性的影响;利用融合突变酶和酶-化学酸联合法分别实现了特定底物的动力学拆分和归一性水解。(1)通过RT-PCR技术从菜豆中克隆出编码PvEH2的cDNA序列,其长度为951 bp,共编码316个氨基酸。氨基酸多序列比对结果显示,PvEH2属于α/β折叠型水解酶超家族。实现了重组PvEH2在大肠杆菌Rosetta(DE3)内的表达,并以rac-环氧苯乙烷(1a)为底物采用单因素和正交试验确定了最佳诱导条件:OD600值0.8,IPTG浓度0.2 mmol·L-1,诱导温度20℃和诱导时间9 h,将产酶活性由17.4 U·L-1发酵液提高至34.3 U·L-1。重组PvEH2的最适反应温度和pH分别为30℃和7.0。在稳定性方面,PvEH2在40和45℃的活性半衰期分别约为82和40 min;在pH为6.58.0的体系中较为稳定,25℃下保持2h后的剩余相对活性均在80%以上。动力学参数显示,PvEH2催化(S)-和(R)-1a的Km与kcat分别为2.12 mmol·L-1和18.86 s-1以及19.65 mmol·L-1和1.02 s-1,PvEH2对于(S)-1a的亲和性和催化效率远高于(R)-1a。(2)利用表达有重组PvEH2的大肠杆菌转化子E.coli/Pveh2进行底物谱分析,结果显示,PvEH2对于rac-1a和rac-1,2环氧己烷(13a)的催化活性最高,分别为8.0和7.8U·g-1湿细胞。除13a外,PvEH2均偏爱于水解S构型底物。对映选择性方面,PvEH2对于rac-1a的对映体选择率(Enantiomeric ratio,E)超过200,是目前已知的所有野生EH中的最高值。PvEH2针对rac-芳基缩水甘油醚类底物(6a10a)表现出中等的E值(6.223.0)。区域选择性方面,PvEH2对于间硝基环氧苯乙烷(3a)和间氯环氧苯乙烷(5a)具有高且互补的区域选择性,即其区域选择性系数αS和βR分别为90.3%和96.4%,以及93.0%和95.8%。以上结果表明PvEH2具有动力学拆分rac-1a和归一性水解rac-3a和rac-5a的潜力。(3)将PvEH2的基因从pET28a(+)转移至冷休克表达质粒pCold II中,构建新的转化子E.coli/pveh2。以rac-1a为底物测得产酶活性由34.3 U·L-1发酵液提高至82.3 U·L-1。底物极低的溶解度以及底物和产物的双重抑制作用是造成水相体系中底物浓度低的主要原因。以E.coli/pveh2冻干细胞作为生物催化剂,在5种亲水性和11种疏水性有机试剂中筛选出正辛烷和丙三醇,并构建有机溶剂/缓冲液催化体系。在优化的正辛烷/缓冲液双相反应体系(相体积比vo·va-1以及rac-1a与细胞的质量比S·C-1分别为4:6和0.8)中,rac-1a的浓度提高至200 mmol·L-1,是原单缓冲液体系的10倍,反应获得>99.5%ees的(R)-1a,其产率为47.8%,容积生产效率为0.96 g·L-1·h-1是目前生物法制备(R)-1a的最高水平。同时还获得93.6%eep的(R)-苯乙二醇(1b),产率与生产效率分别为50.4%和1.16 g·L-1·h-1。在含有5%(v·v-1)丙三醇的缓冲液作为rac-3a归一性水解的反应体系,将最高浓度由原先的10 mmol·L-1提高至40 mmol·L-1。在25℃反应12 h时,底物的转化率c值为97.6%,获得84.9%eep的(R)-间硝基苯乙二醇(3b),其产率为90.2%。(4)为提高PvEH2针对rac-13a的对映选择性和探究cap loop对PvEH2催化其它环氧化物特性的影响,基于理性分析的结果将PvEH2的部分cap loop片段与其它四种植物EH(StEH、PvEH1、VrEH1和VrEH2)的相应区域进行替换,构建并表达四种融合突变酶(Pv2St、Pv2Pv1、Pv2Vr1和Pv2Vr2)。底物谱测量结果显示,融合酶的活性出现了不同程度的降低,但Pv2St和Pv2Pv1的比活性基本保持原酶50%以上的活性。片段的替换虽然没有颠换原酶的构型偏好性,但使得E值发生了较大幅度的变化,其中,Pv2Pv1针对rac-1a的E值由>200降至30.9,而Pv2St对于rac-13a的E值则由2.1提高至24.2。此外,PvEH2的区域选择性在融合突变前后没有显著的改变。以表达有融合酶Pv2St的E.coli/pv2st全细胞为催化剂,确定了缓冲液体系内rac-13a的最高反应浓度为280mmol·L-1。该浓度下的rac-13a能够在4.5 h内被有效拆分,获得>99.5%ees的(S)-13a,其最终浓度、产率以及容积生产效率分别为103.3 mmol·L-1、36.9%和2.30 g·L-1·h-1。在此基础上通过酶-化学酸法实现了rac-13a的归一性水解,所获(R)-1,2-二羟基己烷(13b)的eep值和产率达到73.0%和86.5%。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩略词对照表
  • 第一章 绪论
  •   1.1 环氧化物和邻位二醇
  •     1.1.1 简介
  •     1.1.2 应用价值
  •     1.1.3 合成与制备
  •   1.2 环氧化物水解酶
  •     1.2.1 概述
  •     1.2.2 酶的分类
  •     1.2.3 EH的催化反应机制
  •     1.2.4 酶的立体选择性
  •     1.2.5 酶在生物催化方面的应用研究
  •     1.2.6 EH的分子改造
  •     1.2.7 国内研究进展
  •   1.3 立题意义与研究内容
  •     1.3.1 立题意义
  •     1.3.2 研究内容
  •     1.3.3 研究路线简图
  • 第二章 菜豆环氧化物水解酶Pv EH2 的表达及酶学性质
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验仪器与材料
  •     2.2.1 主要网站与软件
  •     2.2.2 主要仪器信息
  •     2.2.3 菌株、质粒与培养基
  •     2.2.4 主要材料与试剂
  •     2.2.5 主要配制溶剂
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 拟克隆基因的选择
  •     2.3.2 菜豆总RNA与基因组DNA的提取
  •     2.3.3 cDNA与基因组DNA的扩增
  •     2.3.4 Pv EH2 基因的异源表达
  •     2.3.5 Pv EH2 的纯化
  •     2.3.6 Pv EH2 的活性测定
  •     2.3.7 重组Pv EH2 的酶学性质分析
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 菜豆Pv EH2 基因及其上游调控作用元件分析
  •     2.4.2 Pv EH2 的一级序列比对
  •     2.4.3 Pv EH2 的多级序列比对
  •     2.4.4 E.coli/Pveh2 工程菌株的构建
  •     2.4.5 E.coli/Pveh2 诱导条件的优化
  •     2.4.6 重组Pv EH2 的表达、纯化以及SDS-PAGE分析
  •     2.4.7 重组Pv EH2 的酶学性质分析
  •   2.5 本章小结
  • 第三章 Pv EH2 的环氧化物底物谱研究
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验仪器与材料
  •     3.2.1 主要仪器信息
  •     3.2.2 主要网站与软件
  •     3.2.3 实验材料与试剂
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 环氧化物及邻位二醇的手性色谱分析法
  •     3.3.2 Pv EH2 催化活性的测定
  •     3.3.3 Pv EH2 对映选择性的测定
  •     3.3.4 Pv EH2 区域选择性的测定
  •     3.3.5 分子对接模拟分析
  •   3.4 结果与讨论
  •     3.4.1 Pv EH2 的催化活性
  •     3.4.2 Pv EH2 的对映选择性
  •     3.4.3 Pv EH2 的区域选择性
  •     3.4.4 立体选择性的分子对接分析
  •   3.5 本章小结
  • 第四章 Pv EH2 在双相体系内的手性催化反应
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验仪器与材料
  •     4.2.1 主要仪器信息
  •     4.2.2 实验材料与试剂
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 重组Pv EH2 在冷休克表达系统中的表达
  •     4.3.2 代表性环氧化物在单水相中的不对称水解
  •     4.3.3 底物和产物浓度对E.coli/pveh2 催化活性的影响
  •     4.3.4 底物和产物对E.coli/pveh2 细胞存活率的影响
  •     4.3.5 E.coli/pveh2 对有机试剂的耐受性
  •     4.3.6 正辛烷/缓冲液双相催化体系的优化
  •     4.3.7 正辛烷/缓冲液双相体系中rac-1a的立体选择性开环水解
  •   4.4 结果与讨论
  •     4.4.1 全细胞EH活性与SDS-PAGE检测结果
  •     4.4.2 利用E.coli/pveh2 在单水相中催化rac-1a和 rac-3a
  •     4.4.3 底物与产物对水解初速率的抑制作用
  •     4.4.4 底物和产物对E.coli/pveh2 细胞存活率的影响
  •     4.4.5 有机试剂的筛选
  •     4.4.6 正辛烷/缓冲液双相反应体系的优化
  •     4.4.7 正辛烷/缓冲液双相体系中rac-1a的立体选择性开环水解
  •   4.5 本章小结
  • 第五章 替换cap loop提高Pv EH2对1,2-环氧己烷的对映选择性
  •   5.1 引言
  •   5.2 实验仪器与材料
  •     5.2.1 主要仪器信息
  •     5.2.2 实验材料与试剂
  •     5.2.3 主要网站与软件
  •   5.3 实验方法
  •     5.3.1 分子动力学模拟
  •     5.3.2 替换cap loop片段的融合酶基因的构建
  •     5.3.3 重组E.coli转化子的构建
  •     5.3.4 融合酶的表达与纯化
  •     5.3.5 融合酶的催化特性的测定
  •     5.3.6 利用融合酶不对称水解rac-13a
  •   5.4 结果与讨论
  •     5.4.1 替换loop片段的确定
  •     5.4.2 融合酶转化子的构建与表达
  •     5.4.3 融合酶对于rac-13a的对映选择性
  •     5.4.4 融合酶的底物谱分析
  •     5.4.5 融合前后酶的三维结构分析
  •     5.4.6 利用E.coli/pv2st动力学拆分rac-13a
  •     5.4.7 酶-化学酸联合法归一性水解rac-13a
  •   5.5 本章小结
  • 主要结论与展望
  •   主要结论
  •   展望
  • 论文主要创新点
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录1 :作者在攻读博士学位期间发表的成果
  • 附录2 :环氧化物底物信息
  • 附录3 :植物环氧化物水解酶多序列比对
  • 附录4 :其它补充内容
  • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 李闯

    导师: 邬敏辰

    关键词: 环氧化物水解酶,异源表达,立体选择性,动力学拆分,归一性水解

    来源: 江南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,化学

    单位: 江南大学

    分类号: Q946.5;O621.251

    DOI: 10.27169/d.cnki.gwqgu.2019.000076

    总页数: 100

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