西门利克森林病毒逃逸RNA干扰抗病毒机制的研究

论文摘要

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种转录后基因沉默过程,在真菌、植物、无脊椎动物和哺乳动物中发挥抗病毒天然免疫功能。当病毒感染细胞时,其复制过程中产生的病毒双链RNA(dsRNA)被宿主Dicer蛋白识别并加工,形成病毒来源的小干扰RNA(viral siRNA或vsiRNA)。这些病毒来源的vsiRNA被转运至Ago蛋白,形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC),并介导与其同源的病毒mRNA的降解,最终导致病毒被清除,从而到达抗病毒的目的。然而,在长期的进化过程中,许多病毒也会形成了一种免疫逃逸机制,通过编码RNAi抑制子(VSR)来抑制RNAi,逃逸RNAi介导的抗病毒免疫。因此,如何阻断或者放大沉默信号成为病毒和宿主博弈的焦点。西门利克森林病毒(Semliki forest virus,SFV)属于披膜病毒科,甲病毒属,依靠蚊子进行传播。由于其微弱的致病性,因而成为该属的模式病毒。其他的甲病毒还包括辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)等等。在本研究中,我们利用SFV感染埃及伊蚊细胞和人源细胞为模型,发现SFV的Core蛋白可以抑制RNAi。并且通过体外实验发现,Core蛋白通过与dsRNA和siRNA结合抑制RNAi通路,同时还能保护dsRNA不被Dicer切割。当关键残基K124/K128和K139/K142发生突变后,Core蛋白几乎丧失了结合dsRNA和siRNA的能力,而且突变病毒的复制能力也大幅减弱。总的来说,我们发现了一种新的VSR,并揭示其作用机制主要是通过结合dsRNA和siRNA来抑制RNAi。

论文目录

• 论文创新点
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.1 昆虫天然免疫
•     1.1.1 Toll和 IMD通路
•     1.1.2 JAK-STAT通路
•     1.1.3 细胞自噬
•   1.2 哺乳动物天然免疫
•   1.3 RNA干扰
•     1.3.1 三种小RNA通路
•     1.3.2 Dicer家族蛋白
•     1.3.3 Ago家族蛋白
•   1.4 基于RNAi的抗病毒天然免疫
•     1.4.1 RNAi抗病毒免疫过程
•     1.4.2 哺乳动物RNAi抗病毒
•   1.5 病毒来源的小RNA
•     1.5.1 vsiRNA丰度
•     1.5.2 vsiRNA特异性
•     1.5.3 vsRNA与 vsiRNA的生成
•   1.6 病毒逃逸RNAi
•     1.6.1 野田村病毒科的VSR
•     1.6.2 肠道病毒的VSR
•     1.6.3 黄瓜花叶病毒的VSR
•     1.6.4 花椰菜花叶病毒的VSR
•     1.6.5 冠状病毒的VSR
•     1.6.6 基孔肯雅病毒的VSR
•     1.6.7 人类免疫缺陷病毒的VSR
•     1.6.8 流感病毒的VSR
•   1.7 甲病毒
•     1.7.1 甲病毒的分类
•     1.7.2 甲病毒粒子和基因组
•     1.7.3 甲病毒生活周期
•     1.7.4 甲病毒的影响
•     1.7.5 甲病毒的应用
•   1.8 西门利克森林病毒
•     1.8.1 SFV的基因组结构
•     1.8.2 SFV的感染和复制
•     1.8.3 SFV蛋白功能
•     1.8.4 SFV Core蛋白结构
•     1.8.5 基于SFV的药物研发
• 第二章 Core蛋白抑制RNAi
•   2.1 前言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 实验方法
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 实验流程图
•     2.3.2 在S2 细胞中Core蛋白抑制RNAi
•     2.3.3 在293T细胞中Core蛋白抑制RNAi
•     2.3.4 SINV的 Capsid蛋白也能抑制RNAi
•   2.4 讨论
• 第三章 Core蛋白抑制RNAi机制研究
•   3.1 前言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 实验方法
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 Core蛋白在体外结合dsRNA,并抑制RNase III切割dsRNA
•     3.3.2 Core蛋白在细胞内和细胞外结合siRNA
•     3.3.3 Core蛋白拯救B2 缺陷型的FHV复制子
•     3.3.4 Core蛋白VSR功能活性位点确定
•     3.3.5 突变体Core蛋白结合ds RNA和 siRNA能力减弱
•   3.4 讨论
• 第四章 突变病毒复制减弱
•   4.1 前言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 实验方法
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 SFV突变克隆构建与病毒拯救
•     4.3.2 突变型SFV病毒粒子不影响结构完整和感染效率
•     4.3.3 突变型SFV病毒粒子复制效率减弱
•   4.4 讨论
• 研究总结
• 参考文献
• 攻博期间发表的科研成果目
• 致谢
• 附表1:构建SFV的9 个蛋白克隆所用引物
• 附表2:构建Core突变体和SFV突变病毒所用到的引物
• 附表3:荧光定量相关引物
• 附表4:体外转录dsRNA、ssRNA以及探针相关引物

文章来源

类型: 博士论文

作者: 钱齐

导师: 周溪

关键词: 天然免疫系统,西门利克森林病毒,蛋白

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 武汉大学

分类号: Q939.91

DOI: 10.27379/d.cnki.gwhdu.2019.000017

总页数: 90

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