双重RT-RPA法快速检测沙门氏菌及其1类整合酶基因

论文摘要

以重组酶聚合酶扩增法（recombinase polymerase amplification, RPA）为技术基础,建立了一种能单管同时快速鉴定沙门氏菌及其耐药相关1类整合酶基因的双重荧光定量重组酶聚合酶扩增（duplex real-time recombinase polymerase amplification, RT-RPA）方法。该方法以沙门氏菌特异毒力基因fimY和细菌耐药相关1类整合酶基因intI1为靶标序列,设计特异性RPA引物与exo探针,建立双重RT-RPA方法。结果显示,在fimY引物终浓度320 nmol·L-1,intI1引物终浓度400 nmol·L-1,fimY探针终浓度60 nmol·L-1,intI1探针终浓度100 nmol·L-1,反应温度37℃,反应20 min时,双重RT-RPA扩增效率最高,且特异性好。灵敏度试验显示,沙门氏菌检测灵敏度为1.29×101CFU·mL-1,intI1检测灵敏度为1.60×101CFU·mL-1。实际样品检测试验中,前期从生猪养殖场、屠宰场、超市和农贸市场筛选到61株沙门氏菌（2株携带intI1基因）、555株大肠埃希菌（均携带intI1基因）,用建立的双重RT-RPA方法对上述菌株进行检测,可以同时鉴定出沙门氏菌及intI1基因。该方法与传统培养方法和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）法相比,具有特异性强、灵敏度高、速度快（检测时间20 min）等优点,为快速鉴定携带耐药相关整合酶基因intI1的沙门氏菌提供了准确有效的方法,可为耐药有害微生物的快速鉴定奠定基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 试剂与菌株
•   1.2 仪器与设备
•   1.3 引物与探针
•   1.4 细菌培养与基因组提取
•   1.5 浓度梯度样品稀释
•   1.6 RPA方法的建立与优化
•   1.7 特异性实验
•   1.8 灵敏度实验
•   1.9 双重RT-RPA方法在实际菌株鉴定中的应用
• 2 结果与分析
•   2.1 RPA检测方法的建立与双重RT-RPA的优化
•   2.2 特异性实验
•   2.3 灵敏度实验
•   2.4 实验样品的检测
• 3 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 程辉,梁奕,俞圣韬,叶仲杜,蒋晗,朱诚

关键词: 快速检测,沙门氏菌,类整合酶基因

来源: 浙江农业学报 2019年04期

年度: 2019

分类: 农业科技,工程科技Ⅰ辑

专业: 轻工业手工业

单位: 浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室,中国计量大学生命科学学院

基金: 国家自然科学基金(31801655),浙江省自然科学基金(LQ18C200004)

分类号: TS207.4

页码: 661-668

总页数: 8

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