碱蓬脱水素蛋白（SsDHN）的亚细胞定位及功能研究

论文摘要

本研究通过亚细胞定位技术、pull-down技术,从细胞结构及蛋白水平对碱蓬脱水素基因进行研究,同时通过观察在盐胁迫条件下,转碱蓬脱水素基因的烟草与野生型烟草的亚细胞超微结构的变化,揭示脱水素基因在植物中的耐盐机理。主要得出以下结论:1.首先运用生物信息学技术对SsDHN基因氨基酸序列进行聚类分析,结果表明碱蓬脱水素蛋白SsDHN为混合型蛋白,与三叶草脱水素蛋白亲缘关系较近,与苦瓜脱水素蛋白的亲缘关系较远,这与序列同源性比对结果一致。2.本实验通过瞬时表达的方法,对碱蓬脱水素蛋白进行了亚细胞定位研究。通过构建了Super1300-SsDHN-GFP融合表达载体,运用瞬时表达的方法,用共聚焦显微镜观察,结果表明碱蓬脱水素基因定位在叶绿体上。3.本试验研究了不同盐浓度下野生型烟草和转脱水素基因烟草的叶绿体超微结构的变化。在盐胁迫条件下,转脱水素基因烟草的叶绿体发生了损伤但损伤不大,转碱蓬脱水素基因的烟草,在高浓度盐胁迫时,有许多淀粉粒产生,这使得细胞中溶液的浓度较之前增高,保证植物细胞的水分的吸收,可以减轻由于盐胁迫造成的植物细胞内水分减少的现象而野生型烟草叶片的叶绿体的外形膨胀,小部分叶绿体出现了团聚现象,且有向细胞中央移动的趋势,小部分叶绿体发生质壁分离的现象明显。少数叶绿体内类囊体膜溶解、破裂出现较小的空泡,基质片层凝集成束,部分位置膨胀,排列紊乱。基粒片层局部模糊不清。没有淀粉粒出现,嗜饿颗粒数目变少,体积小。试验结果证明,转脱水素基因烟草比野生型烟草更具有耐盐性。4.本研究构建了碱蓬脱水素基因的原核表达载体DE3-Pet32a-SsDHN进行诱导表达。应用SDS-PAGE电泳检测目标蛋白,结果表明符合预期的大小。然后应用Ni-NTA树脂法,纯化带有His标签的SsDHN蛋白,进行pull-down分析,对得到的均一的条带进行质谱分析。得到免疫球蛋白、4个烟草疫霉菌蛋白、H3内结构域的拟南芥蛋白、果糖二磷酸醛缩酶I、内切葡聚糖酶,可能与脱水素蛋白发生互作的蛋白,为后续继续研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 脱水素的结构特征及功能
•     1.1.1 脱水素与干旱胁迫
•     1.1.2 脱水素与冷胁迫
•     1.1.3 脱水素的抗氧化作用
•   1.2 亚细胞定位技术介绍及应用
•     1.2.1 融合报告基因定位技术
•     1.2.2 免疫组织化学定位法
•     1.2.3 蛋白质组学定位法
•     1.2.4 生物信息学预测
•     1.2.5 共分离标记酶辅助定位法
•     1.2.6 脱水素在植物组织和器官中的定位
•   1.3 叶绿体的概述
•     1.3.1 叶绿体的超微结构
•   1.4 蛋白质互作技术介绍及应用
•     1.4.1 酵母双杂交技术
•     1.4.2 免疫共沉淀技术
•     1.4.3 pull-down技术
•   1.5 本研究的目的及意义
• 第二章 碱蓬脱水蛋白生物信息学分析及亚细胞定位的研究
•   2.1 实验材料与试剂仪器
•     2.1.1 试验材料
•     2.1.2 菌株及载体
•     2.1.3 试验试剂
•     2.1.4 试验仪器
•     2.1.5 亚细胞定位试验材料
•     2.1.6 亚细胞定位试验试剂
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 生物信息学分析
•     2.2.2 引物设计
•     2.2.3 目的基因胶回收与TA克隆
•     2.2.4 转化平板的制备
•     2.2.5 植物重组表达载体的构建
•     2.2.6 .GV3101 农杆菌感受态细胞的制备及转化
•     2.2.7 转化菌液的准备
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 脱水素基因SsDHN的生物信息学分析
•     2.3.2 PBI121-SsDHN质粒PCR鉴定
•     2.3.3 克隆载体和融合基因表达载体双酶切
•     2.3.4 碱蓬脱水素SsDHN蛋白亚细胞定位分析
•   2.4 讨论
• 第三章 盐胁迫对转SSDHN基因的烟草叶绿体超微结构影响
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 试验材料培养及处理
•     3.1.2 试验试剂
•     3.1.3 仪器设备
•   3.2 试验方法
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 在未受盐胁迫下野生型与转基因型烟草叶绿体超微结构的变化
•     3.3.2 在100mmol·L-1Na Cl胁迫处理下烟草叶绿体超微结构的变化
•     3.3.3 在200mmol·L-1Na Cl胁迫处理下烟草叶绿体超微结构的变化
•   3.4 讨论
•     3.4.1 盐胁迫对野生型烟草的叶绿体超微结构的影响
•     3.4.2 盐胁迫对转基因烟草的叶绿体超微结构的影响
• 第四章 脱水素蛋白SSDHN互作蛋白的筛选
•   4.1 试验材料与试剂
•     4.1.1 菌株与载体
•     4.1.2 试验试剂
•     4.1.3 主要仪器及设备
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 重组质粒构建
•     4.2.2 诱导表达Pet32a-Ss DHN蛋白
•     4.2.3 蛋白的纯化
•     4.2.4 PET-32a-Ss DHN蛋白纯化后检测
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 PET-32a-Ss DHN重组载体构建
•     4.3.2 PET-32a质粒双酶切
•     4.3.3 p ET-32a-Ss DHN重组表达载体质粒双酶切鉴定
•     4.3.4 诱导表达PET-32a-Ss DHN蛋白电泳结果
•     4.3.5 Ni-NTA纯化PET-32a-Ss DHN蛋白
•     4.3.6 分子筛层析结果
•     4.3.7 His-Ss DHN蛋白最终纯化
•     4.3.8 His-Ss DHN蛋白的Western Blot分析
•     4.3.9 蛋白浓度测定
•     4.3.10 脱水素基因Ss DHN的His-pull-down结果
•     4.3.11 质谱分析
•   4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马宝月

导师: 马慧

关键词: 脱水素,耐盐,亚细胞定位,原核表达

来源: 沈阳农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 沈阳农业大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27327/d.cnki.gshnu.2019.000255

总页数: 64

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