植物乳杆菌YM-4-3菌株中fol B和fol K基因对其叶酸生物合成的影响

论文摘要

叶酸是人类饮食中必须的微量元素,涉及许多代谢途径,主要在碳转移反应如嘌呤和嘧啶生物合成和氨基酸互变中。研究表明动物细胞不能自主合成叶酸,只能通过食物摄取获得,因此一旦所摄取叶酸过少,即会引起机体发生相应的叶酸缺乏性疾病。随着叶酸生物合成途径的逐渐明朗,为了提高天然叶酸产量进而满足人类需求,通过基因工程的方法改变植物或微生物中叶酸的代谢受到相当重视。其中研究报道了fol B、fol K基因可能在叶酸生物合成中的起着重要作用,但是这两个基因对细菌中生物合成叶酸的作用机理和具体作用的研究尚未明确。本研究首先对Lb.plantarum YM-4-3叶酸生物合成途径中关键基因fol E、fol K、fol P、fol B及fol Q进行序列比对、拼接后发现,这些基因在基因组中以基因簇形式存在;并找到fol B和fol K基因的开放阅读框,翻译成氨基酸序列,对这两个基因表达的蛋白进行了NCBI序列比对,对其性质及功能进行了预测后通过GO分析对这两个基因进行功能注释。结果发现两者都与植物乳杆菌的叶酸生物合成有密切联系。之后,本研究利用组成型表达质粒pMG36e对Lb.plantarum YM-4-3的fol B和fol K基因进行过表达来研究其对植物乳杆菌叶酸合成及生长的作用。对Lb.plantarum YM-4-3的fol B和fol K进行PCR扩增后,通过酶切连接的方法构建过表达重组质粒,并电击转化进入Lb.plantarum YM-4-3菌株中,成功构建过表达fol B和fol K基因的H-fol B和H-fol K菌株;定量PCR结果显示,fol B基因在H-fol B菌株表达量是野生型菌株YM-4-3的33倍,fol K基因在H-fol K菌株表达量是野生型菌株YM-4-3的88倍;但是无论是H-fol B菌株还是H-fol K菌株发酵液中叶酸含量相比野生型菌株低,且H-fol B菌株的生长速率较野生型菌株的生长速率要慢很多。但从单个细胞的角度来说,H-fol B菌株单个细胞内叶酸的含量要比野生型菌株的高许多。从叶酸的构型来看,其中喋呤二谷氨酸和喋呤六谷氨酸的含量最低;12h时喋呤单谷氨酸占总叶酸含量的百分比较其他时间要低,这可能是因为细菌刚开始产的是喋呤多谷氨酸,但喋呤多谷氨酸不稳定,随着时间的推移便转化成喋呤单谷氨酸。为更加确定两基因对植物乳杆菌生物合成叶酸的影响,本研究还通过同源重组的基因敲除技术对Lb.plantarum YM-4-3的fol B、fol K基因进行敲除。首先对目的基因上下游同源片段进行PCR扩培（各基因序列大约1000 bp左右）,再利用重叠PCR连接上下游同源臂,得到大小约为2000 bp的条带（UP-DOWN）,然后利用温度敏感性质粒pFDE760和UP-DOWN构建重组质粒也就是敲除载体,通过热转把敲载导入大肠杆菌DH5α,涂布,28℃培养,获得重组质粒,再利用电击的方法把重组质粒转化到植物乳杆菌YM-4-3,最后通过温度变化等一系类操作筛选敲除子,然而进一步可以通过设计相应引物及送公司测序验证敲除是否成功。本实验系统的研究了叶酸生物合成途径关键基因fol B、fol K基因的功能,为研究植物乳杆菌叶酸生物合成途径的分子调控机理奠定了理论基础,为开发富含叶酸的功能性食品提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 叶酸简介
•     1.1.1 叶酸的结构与性质
•     1.1.2 叶酸的生理功能
•     1.1.3 叶酸的来源
•     1.1.4 产叶酸菌株的研究
•   1.2 乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）概述
•   1.3 叶酸的合成方法
•     1.3.1 化学方法
•     1.3.2 生物方法
•   1.4 叶酸的合成途径研究现状
•   1.5 组学研究现状
•     1.5.1 乳酸菌组学研究现状
•     1.5.2 植物乳杆菌基因组及代谢途径的研究现状
•   1.6 叶酸的检测方法
•     1.6.1 食物中叶酸含量的测定
•     1.6.2 血清中叶酸含量的测定
•   1.7 研究的目的和意义
•   1.8 研究内容
•   1.9 实验路线
• 第二章 Fol B和 Fol K基因及其表达蛋白的功能预测比对分析
•   2.1 引言
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 使用本地Blast寻找YM-4-3 基因组中的fol b和 fol k序列
•     2.2.2 Fol B与 Fol K蛋白一级结构分析
•     2.2.3 Fol B与 Fol K的系统发育树构建及二级结构预测
•     2.2.4 Fol B与 Fol K蛋白单体的三级结构分析及同源建模
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 Fol B与 Fol K蛋白的氨基酸组成特性、等电点预测及亲/疏水性分析
•     2.3.2 Fol B与 Fol K的进化树构建及二级结构分析
•   2.4 小结
• 第三章 Lb.plantarum YM-4-3的fol B和 fol K基因的过表达株构建及叶酸含量测定
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验菌株
•     3.2.2 实验引物
•     3.2.3 实验仪器
•     3.2.4 实验试剂
•     3.2.5 培养基及试剂配制
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 fol B、fol K表达片段扩增与测序
•     3.3.2 植物乳杆菌YM-4-3 基因组提取
•     3.3.3 过表达载体构建与验证
•     3.3.4 过表达菌株的筛选
•     3.3.5 RNA提取
•     3.3.6 荧光定量PCR（Real-time Qμantitative PCR）
•     3.3.7 叶酸测定
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 过表达菌株的成功构建
•     3.4.2 过表达菌株H-fol B和 H-fol K构建成功
•     3.4.3 基因表达水平检测
•     3.4.4 叶酸测定结果
•   3.5 讨论
•   3.6 小结
• 第四章 Lb.plantarum YM-4-3的fol B、fol K基因敲除株构建
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 实验菌株
•     4.2.2 实验质粒及引物
•     4.2.3 实验仪器
•     4.2.4 实验试剂
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 fol B、fol K基因同源臂的克隆与测序
•     4.3.3 质粒p FED760 的转化与提取
•     4.3.4 目的片段与载体的酶切与连接
•     4.3.5 植物乳杆菌YM-4-3 电转化感受态细胞的制备及电转方法
•     4.3.6 p FED760 温度敏感型质粒的基因敲除原理
•     4.3.7 植物乳杆菌YM-4-3 fol B、fol K基因的敲除
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 植物乳杆菌YM-4-3 fol B、fol K基因位置及序列确定
•     4.4.2 敲除载体构建验证
•     4.4.3 敲除载体成功导入YM-4-3 感受态细胞
•     4.4.4 敲除载体整合进基因组验证
•   4.5 讨论
•   4.6 小结
• 第五章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 龙云

导师: 柳陈坚

关键词: 植物乳杆菌,叶酸,基因过表达,基因敲除

来源: 昆明理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业,轻工业手工业

单位: 昆明理工大学

分类号: TS218;TS201.3

DOI: 10.27200/d.cnki.gkmlu.2019.001552

总页数: 76

文件大小: 5106K

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