家蚕Bmhsp19.9基因在培育对极端温度耐受的家蚕品种中的应用论文和设计-蒋亮

全文摘要

本发明公开了家蚕Bmhsp19.9基因在培育对极端温度耐受的家蚕品种中的应用，家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，通过在细胞水平和转基因家蚕水平增量表达家蚕Bmhsp19.9基因，能够提高细胞和转基因家蚕在高温胁迫下的存活率，同时能够提高转基因家蚕在低温环境下的生长速度，因此Bmhsp19.9基因是一个影响家蚕对极端环境温度耐受力的关键基因，可为家蚕转基因抗性品种的培育提供理论基础和靶标基因；本发明还提供了家蚕Bmhsp19.9基因的启动子，可以在极端温度下调控下游基因的表达。

主设计要求

1.增量表达家蚕Bmhsp19.9基因在培育对低温或高温耐受的家蚕品种中的应用，其特征在于：所述家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

设计方案

1.增量表达家蚕Bmhsp19.9基因在培育对低温或高温耐受的家蚕品种中的应用，其特征在于：所述家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的方法为在家蚕中通过家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9超量表达，所述家蚕hsp19.9启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的方法，构建家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体，通过胚胎显微注射制备转基因家蚕，获得在增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的家蚕。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体由以下方法制备：

(1)以SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15为引物克隆然后以含Bmhsp19.9基因的质粒为模板进行扩增，扩增产物经BamH I和Not I酶切后连入经同样酶切的1180-hr3-39KP-ep32-SV40载体，得到1180-hr3-Bmhsp19.9-SV40载体；

(2)以家蚕基因组DNA为模板，克隆如SEQ ID NO.12所示的家蚕hsp19.9启动子，然后将hsp19.9启动子连入1180-hr3-Bmhsp19.9-SV40载体的Sal I和BamH I酶切位点处，得到1180-hr3-hsp19.9P1-Bmhsp19.9-SV40载体；

(3)将步骤(2)得到的1180-hr3-hsp19.9P1-Bmhsp19.9-SV40载体用Asc I单酶切，然后与经Asc I单酶切piggyBac[3×p3 DsRed afm]的载体连接，获得转基因载体piggyBac[hr3-hsp19.9P1-Bmhsp19.9-SV40-3×p3 DsRed afm]。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述低温为低于25℃、高于或等于13℃；所述高温为高于25℃、低于或等于37℃。

6.一种制备对极端温度耐受家蚕品种的方法，其特征在于，具体步骤如下：在家蚕中通过家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9超量表达，所述家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述家蚕hsp19.9启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ IDNO.13所示。

7.根据权利要求6所述的制备对极端温度耐受家蚕品种的方法，其特征在于：具体步骤如下：构建家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体，通过胚胎显微注射制备转基因家蚕即可。

8.家蚕Bmhsp19.9基因启动子，其特征在于：所述家蚕Bmhsp19.9基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示。

9.权利要求8所述家蚕Bmhsp19.9基因启动子在低温或高温上调控下游基因目的表达中的应用。

设计说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及家蚕Bmhsp19.9基因在培育对极端温度耐受的家蚕品种中的应用，还涉及培育对极端温度耐受家蚕品种的方法，以及极端温度调控Bmhsp19.9基因表达的启动子。

背景技术

家蚕是一种重要的经济昆虫，蚕丝是丝绸工业的重要原料。在我国很多农村地区，养蚕业是当地经济的支柱性产业和农民的主要经济收入来源，蚕丝业每年为蚕农创收上百亿元。家蚕是变温动物，其生长、发育、繁育都受到环境温度的影响。家蚕的最适饲养温度为25℃，剧烈的环境温度变化会给养蚕业带来严重影响。低温引起家蚕生长缓慢、发育不整齐；高温导致各种蚕病的发生，降低蚕茧产量及茧丝质量。

由于剧烈变化的环境温度对养蚕业的严重危害，科研工作者一直希望找出影响家蚕对极端环境温度抗性的关键基因，然后通过分子生物技术来提高家蚕对极端环境温度的抗性。对影响家蚕极端环境温度耐受性的关键基因全长序列进行克隆和鉴定，为阐明家蚕抵抗剧烈环境温度变化的机制，以及培育抗性品种应用于蚕业生产有着重要的理论价值和实践意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种增量表达家蚕Bmhsp19.9基因在培育对低温或高温耐受的家蚕品种中的应用；本发明克隆了家蚕Bmhsp19.9基因，RT-PCR结果显示该基因在家蚕发育的各时期都表达，且在家蚕精巢中高量表达，被高温(37℃)和低温(13℃)诱导上调表达；构建hsp19.9P1和hsp19.9P2分别介导Bmhsp19.9增量表达的瞬时转染载体，转染BmE细胞后，qPCR和Western Blot检测都证明hsp19.9P1的活性高于hsp19.9P2。利用hsp19.9P1介导Bmhsp19.9在BmE细胞中增量表达，在高温处理后的细胞存活率显著高于对照。构建hsp19.9P1介导Bmhsp19.9增量表达的转基因载体，通过胚胎显微注射制备转基因家蚕，和非转基因对照相比，转基因家蚕在高温处理后的死亡率显著降低，在低温饲养条件下的存活率和幼虫体重显著增加，发育更快。这些结果说明Bmhsp19.9基因是一个影响家蚕对极端环境温度耐受力的关键基因，可作为家蚕转基因抗性品种培育的靶标基因。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

增量表达家蚕Bmhsp19.9基因在培育对低温或高温耐受的家蚕品种中的应用，所述家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的方法为在家蚕中通过家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9超量表达，所述家蚕hsp19.9启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

优选的，所述增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的方法，构建家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体，通过胚胎显微注射制备转基因家蚕，获得在增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的家蚕。

优选的，所述家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体由以下方法制备：

优选的，所述低温为低于25℃、高于或等于13℃；所述高温为高于25℃、低于或等于37℃。

本发明的目的之二在于提供一种制备对极端温度耐受家蚕品种的方法，提供如下技术方案：

一种制备对极端温度耐受家蚕品种的方法，具体步骤如下：在家蚕中通过家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9超量表达，所述家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述家蚕hsp19.9启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

优选的，具体步骤如下：构建家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体，通过胚胎显微注射制备转基因家蚕即可。

进一步优选，(1)首先根据家蚕基因组序列设计特异引物，以家蚕5龄3天的全蚕cDNA为模板扩增Bmhsp19.9，以全蚕基因组DNA为模板扩增hsp19.9P1和hsp19.9P2，获得了目的条带，PCR产物回收后与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明Bmhsp19.9基因的全长序列及启动子hsp19.9P1、hsp19.9P2被成功克隆，克隆获得了534bp的Bmhsp19.9基因CDS全长序列，及1441bp的hsp19.9P1启动子序列和417bp的hsp19.9P2启动子序列；

(2)以Bmhsp19.9基因的全长CDS序列作为靶标，设计N端含Flag标签和C端含His标签的增量表达引物，以克隆的Bmhsp19.9基因的CDS质粒为模板进行PCR扩增，对目的条带进行回收、连接和转化，筛选阳性克隆后测序。利用1180空载构建包括Hr3增强子、hsp19.9P1(或hsp19.9P2)启动子、Bmhsp19.9基因(含Flag和His标签)以及SV40终止信号序列的瞬时增量表达载体P1hsp19.9和P2hsp19.9；将hr3-hsp19.9P1-Bmhsp19.9-SV40添加到pBac[3×p3 DsRed afm]构建转基因增量表达载体pb-H19.9。

(3)将家蚕品种P50通过15℃低温催青解除滞育，将产下的非滞育蚕卵收集好，在蚕卵产后2h-4h用显微注射仪内将3-4nl、总浓度为400ng\/ul的混合质粒(增量表达载体pb-H19.9和辅助质粒按1:1混合)注射进蚕卵蚕卵，然后用无毒胶水将注射孔封住；将完成注射的蚕卵在35％的甲醛蒸汽中消毒4min后，置于25℃、相对湿度为80％的环境中进行催青直到孵化，将孵化的蚁蚕置于标准条件中饲养，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或者回交，将滞育性的G1代蚕卵即时浸酸解除滞育，胚胎发育第六天在荧光显微镜下面筛选转基因阳性个体，将获得的转基因品系H19.9A和H19.9B正常饲养，继代扩大群体数量。

(4)取转基因系统H19.9A和H19.9B及非转基因P50的3龄和4龄起蚕用于qPCR检测，取H19.9A和对照5龄家蚕的多个组织进行qPCR和Western Blot检测，结果显示转基因家蚕体内Bmhsp19.9表达量显著高于对照。

(5)将转基因家蚕H19.9A和H19.9B及对照P50家蚕的5龄起蚕进行35℃高温处理49h，统计死亡率到上簇，发现转基因家蚕的死亡率显著低于对照。将H19.9A和对照P50的5龄起蚕一直饲养在13℃，13天后部分H19.9A幼虫(没有任何P50个体)开始熟蚕上簇，统计结果显示H19.9A的存活率和存活幼虫的体重显著高于对照。

本发明的目的之三在于提供家蚕Bmhsp19.9基因启动子，提供如下技术方案：

家蚕Bmhsp19.9基因启动子，所述家蚕Bmhsp19.9基因启动子的核苷酸序列如SEQID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

将家蚕Bmhsp19.9基因启动子介导Bmhsp19.9基因表达的质粒分别转染进BmE细胞，24h和48h后提取RNA检测Bmhsp19.9基因表达量，48h后提取蛋白用His标签的抗体进行western blot检测；结果表明hsp19.9P1和hsp19.9P2均能调控Bmhsp19.9基因表达，且hsp19.9P1的启动子活性高于hsp19.9P2。

本发明的目的之四在于提供家蚕Bmhsp19.9基因启动子的应用，提供如下技术方案：

所述家蚕Bmhsp19.9基因启动子在低温或高温条件下调控下游目的基因表达中的应用。优选的，所述目的基因为Bmhsp19.9基因。

本发明的有益效果在于：本发明克隆了家蚕的一个影响家蚕对极端环境温度耐受力的关键基因Bmhsp19.9的全长CDS序列及其启动子hsp19.9P1的序列，该基因在家蚕发育的各时期都表达，被高、低温诱导上调。为了研究该基因的功能，以该基因的全长CDS序列作为靶标，构建Bmhsp19.9的天然启动子hsp19.9P1介导其瞬时增量表达载体，转染BmE细胞后能够显著提高在高温处理下的细胞存活率；进而构建了转基因增量表达载体，通过转基因显微注射，筛选得到转基因阳性个体，增量表达该基因的转基因家蚕对高、低温的抵抗力都显著提高。因此，该基因不但可以提高家蚕对剧烈变化的环境温度的耐受能力，也能使不具备家蚕最适温度的地区和季节可以饲养家蚕，在家蚕转基因抗逆育种的研究和应用中具有重要价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为Bmhsp19.9表达模式检测(A：RT-PCR检测Bmhsp19.9在家蚕发育的各时期表达情况，1：2天的蚕卵，2：4天的蚕卵，3：6天的蚕卵，4：8天的蚕卵，5：蚁蚕，6：一龄眠蚕，7：二龄起蚕，8：二龄眠蚕，9：三龄起蚕，10：三龄眠蚕，11：四龄起蚕，12：四龄眠蚕，13：五龄起蚕，14：2天的蚕蛹，15：4天的蚕蛹，15：6天的蚕蛹，17：8天的蚕蛹，18：蚕蛾；B：qPCR检测Bmhsp19.9在各组织表达情况，在精巢高量表达；C：Bmhsp19.9被高温37℃上调表达，Bmhsp19.9被低温13℃诱导上调表达)。

图2为Bmhsp19.9启动子克隆和鉴定(A：Bmhsp19.9的两个启动子hsp19.9P1和hsp19.9P2，B：克隆了构建hsp19.9P1和hsp19.9P2分别介导Bmhsp19.9增量表达的载体P1hsp19.9和P2hsp19.9；C：转染BmE细胞后进行检测，qPCR证明Bmhsp19.9表达量在转染P1hsp19.9的细胞中最高；D：转染BmE细胞后进行检测，western blot证明Bmhsp19.9表达量在转染P1hsp19.9的细胞中最高)。

图3为细胞正常培养温度为27℃，在BmE细胞转染P1hsp19.9和1180对照质粒后48h，进行17℃低温和37℃高温处理的存活率(A：17℃低温处理；B：37℃高温处理)。

图4为增量表达Bmhsp19.9的转基因家蚕的制备和检测(A：hr3增强子+hsp19.9P1介导Bmhsp19.9增量表达的转基因载体，制备了转基因家蚕品系H19.9A和H19.9B；B：qPCR检测Bmhsp19.9在转基因家蚕整个幼虫中的表达情况；C：Bmhsp19.9在不同组织中的表达情况；D：western blot检测Bmhsp19.9的表达。

图5为死亡率和幼虫体重检测(A：将转基因家蚕H19.9A和H19.9B及对照P50家蚕的5龄起蚕进行35℃高温处理49h，统计到上簇的累计死亡率；B：将H19.9A和对照P50的5龄起蚕一直饲养在13℃，13天后部分H19.9A幼虫(没有任何P50个体)开始熟蚕上簇，统计结果显示H19.9A的存活率显著高于P50对照；C：对存活个体的体重进行称量统计，发现H19.9A的体重显著高于对照。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、Bmhsp19.9基因全长CDS序列克隆及表达模式检测

(1)首先根据家蚕基因组序列设计Bmhsp19.9的特异引物具体引物如下：

19.9ORF-F：5'-atgtcgttgattccgtggttatt-3'(SEQ ID NO.1)，19.9ORF-R：5'-ttaagccttgtcgccgttg-3'(SEQ ID NO.2)。以家蚕5龄3天的整蚕cDNA为模板,SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、60℃退火40秒、72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T载体连接，连接反应在T4DNA 连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明我们成功克隆了全长为534bp的Bmhsp19.9基因的CDS序列，具体序列如SEQ ID NO.3所示。

(2)以2、4、6、8天的蚕卵、蚁蚕、一龄眠蚕、二龄起蚕、二龄眠蚕、三龄起蚕、三龄眠蚕、四龄起蚕、四龄眠蚕、五岭起蚕、2、4、6、8天的蚕蛹及蚕蛾的cDNA作为模板，以Bmhsp19.9基因的特异引物进行RT-PCR检测，具体引物如下：

19.9qPCR-F：5'-gaaggcaaacacgaggagaa-3'(SEQ ID NO.4)，19.9qPCR-F-R：5'-ctgggtgcgattacagacaac-3'(SEQ ID NO.5)；PCR扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸10秒，共28个循环，最后72℃延伸10分钟；以家蚕看家基因TIF-4A作为内参，以其特异引物进行RT-PCR检测，具体引物如下：TIF-4AqRT-F：5'-gaatggaccctgggacactt-3'(SEQ ID NO.6)，TIF-4AqRT-R：5'-ctgactgggcttgagcgata-3'(SEQ ID NO.7)PCR扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸10秒，共27个循环，最后72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳电泳结果显示Bmhsp19.9在家蚕的各发育时期都有表达(图1，A)。

(3)以家蚕5龄3天幼虫的头、表皮、中肠、脂肪体、血液、丝腺、马氏管、气管、精巢、卵巢等组织的cDNA作为模板，用Bmhsp19.9基因的特异引物19.9qPCR和内参基因TIF-4A的特异引物TIF-4AqRT进行qPCR检测，按照仪器和试剂盒的说明书进行操作，结果显示Bmhsp19.9在精巢中的表达量最高(图1，B)。

(4)取家蚕5龄幼虫进行低温(13℃)、高温(37℃)和正常温度(25℃)处理，在处理的6h、12h、24h和36h提取整蚕RNA并反转录成cDNA，用Bmhsp19.9基因的特异引物19.9qPCR和内参基因TIF-4A的特异引物TIF-4AqRT进行qPCR检测，结果显示Bmhsp19.9被高温和低温诱导上调表达(图1，C)。

实施例2、Bmhsp19.9基因启动子hsp19.9P1和hsp19.9P2的克隆及鉴定

(1)提取Bmhsp19.9基因翻译起始位点ATG上游约1500bp的家蚕基因组序列进行启动子和调控元件预测，然后设计hsp19.9P1和hsp19.9P2的特异引物，具体引物如下：

hsp19.9P1-F：5'-gtcgacttcaatccatattatcatttttc-3'(SEQ ID NO.8)，hsp19.9P1-R：5'-ggatccgttgtagatttgtaaagatgctc-3'(SEQ ID NO.9)；hsp19.9P2-F：5'-gtcgacagtacttcatgaactgcctg-3'(SEQ ID NO.10)，hsp19.9P1-R：5'-ggatccgttgtagatttgtaaagatgctc-3'(SEQ ID NO.11)。以家蚕整蚕基因组DNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、51℃退火40秒、72℃延伸70秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T载体连接，连接反应在T4DNA连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明我们成功克隆了Bmhsp19.9基因的长度为1441bp的启动子hsp19.9P1和长度为417bp的启动子hsp19.9P2(图2，A)，序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。

(2)以Bmhsp19.9基因的全长CDS序列作为靶标，设计N端含Flag标签和C端含His标签的增量表达引物hsp19.9OE-F：5'-ggatccatggattacaaggatgacgatgacaagtcgttgattccgtggttatt-3'(SEQ ID NO.14)，hsp19.9OE-R：5'-gcggccgcttaatgatggtgatggtggtgagccttgtcgccgttg-3'(SEQ ID NO.15)，以克隆的Bmhsp19.9基因的CDS质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、60℃退火40秒、72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；对扩增出的目的条带进行回收、连接和转化，筛选阳性克隆后测序。将测序验证成功的质粒用BamH I和Not I进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得Bmhsp19.9酶切片段。用BamH I和Not I双酶切已经包含Hr3增强子和SV40终止信号序列的1180载体(1180-hr3-39KP-ep32-SV40，见基于转基因工程的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)抗性素材创新及抗性机制研究，蒋亮，西南大学博士论文.2013)，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得1180-hr3-SV40酶切片段。将Bmhsp19.9酶切片段和1180-hr3-SV40酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆，得到1180-hr3-Bmhsp19.9-SV40载体。将hsp19.9P1和hsp19.9P2的T克隆质粒及1180-hr3-Bmhsp19.9-SV40载体用Sal I和BamH I进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得hsp19.9P1、hsp19.9P2和1180-hr3-Bmhsp19.9-SV40的酶切片段。将hsp19.9P1和hsp19.9P2酶切片段分别与1180-hr3-Bmhsp19.9-SV40酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆，得到1180-hr3-hsp19.9P1-Bmhsp19.9-SV40载体(P1hsp19.9)和1180-hr3-hsp19.9P2-Bmhsp19.9-SV40载体(P2hsp19.9)(图2，B)。

(3)将P1hsp19.9、P2hsp19.9和1180空载质粒分别转染进BmE细胞，在转染后24和48h提取RNA并反转录成cDNA，用Bmhsp19.9基因的特异引物19.9qPCR和内参基因TIF-4A的特异引物TIF-4AqRT进行qPCR检测，结果显示Bmhsp19.9基因在转染P1hsp19.9的细胞中表达量最高(图2，C)。

(4)在转染后48h提取蛋白，用His标签及内参蛋白GAPDH的抗体进行Western Blot检测，按照仪器和试剂盒的说明书进行操作，结果显示Bmhsp19.9蛋白含量在转染P1hsp19.9的细胞中最高(图2，D)。

以上结果表明hsp19.9P1的启动子活性显著高于hsp19.9P2。

实施例3、增量表达Bmhsp19.9基因提高BmE细胞耐热能力

(1)BmE细胞正常培养温度为27℃，将P1hsp19.9和1180空载质粒分别转染进BmE细胞，在转染后48h进行17℃处理72h，然后用CellTiter 设计图

家蚕Bmhsp19.9基因在培育对极端温度耐受的家蚕品种中的应用论文和设计

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