Pyrococcus yayanosii CH1 L-天冬酰胺酶的分子改造及表达优化

论文摘要

L-天冬酰胺酶（E.C.3.5.1.1）催化L-天冬酰胺水解生成L-天冬氨酸和氨,在医药和食品行业中都具有重要应用。在医药行业中,L-天冬酰胺酶能降解肿瘤细胞代谢所必须的L-天冬酰胺,抑制肿瘤细胞生长,进而被用到治疗淋巴瘤细胞白血病当中;在食品行业中,L-天冬酰胺酶能降解食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的前体L-天冬酰胺,从而减少丙烯酰胺的含量。然而无论是在医药还是在食品行业中,L-天冬酰胺酶依然存在热稳定性差、催化效率低等问题,同时较低的产量,也限制了L-天冬酰胺酶的应用。因此,鉴定和构建出热稳定性更好、比酶活更高的L-天冬酰胺酶,并实现高产表达具有重要的研究意义。本研究表征了嗜热菌Pyrococcus yayanosii CH1来源L-天冬酰胺酶的酶学特性,并解析了影响其热稳定性的关键功能结构域,通过高通量筛选得到酶活更高和热稳定性更好的嗜热L-天冬酰胺酶突变株,并通过表达元件筛选、发酵工艺优化实现L-天冬酰胺酶的高产发酵。主要研究结果如下:（1）以食品安全菌株枯草芽孢杆菌168为宿主菌,分别表达了非嗜热菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌B11-06）来源L-天冬酰胺酶和嗜热菌（P.yayanosii CH1、Thermococcus gammatolerans EJ3、P.furiosus DSM 3638）来源L-天冬酰胺酶。在摇瓶发酵水平,P.yayanosii CH1 L-天冬酰胺酶（PYA）表达量最高,达到89.03U?mL-1,展现出较好的发酵潜力。解析P.yayanosii CH1 L-天冬酰胺酶的酶学性质,最适温度和pH分别为95°C和8.0,并具有较高比酶活(1483.81 U?mg-1)。同时该酶展现出良好的热稳定性和碱性条件下的稳定性,在85°C下半衰期(T（1/2,85°C）)达到105分钟,并且37°C储藏1个月残余酶活仍能保留90%以上;在pH=10环境中储藏30小时,残余酶活仍能保留80%以上。（2）利用生物信息学分析了千余种嗜热与非嗜热L-天冬酰胺酶亲缘关系和残基保守性,发现嗜热与非嗜热L-天冬酰胺酶高度保守区域附近存在特异性氨基酸残基,这些残基在嗜热和非嗜热L-天冬酰胺酶中分别高度保守,但二者之间却不相同,推测可能由于这些氨基酸残基位点及其所在功能结构域的改变,造成L-天冬酰胺酶分化为嗜热和非嗜热L-天冬酰胺酶。为了验证这些位点及功能结构域,对这两类L-天冬酰胺酶的特异性位点及功能结构域进行了替换改造。利用蛋白质结构模型比对、分子动力学模拟等手段解析了造成热稳定性差异的关键残基（PYA残基D51和K298,对应E.coli L-天冬酰胺酶的残基G57和L305）,并发现L-天冬酰胺酶的活性中心附近Loop环柔韧性、表面电荷的高低、C端α-螺旋与C端尾部连接的紧密程度直接影响着L-天冬酰胺酶的热稳定性。基于此结论,我们对大肠杆菌来源医药用L-天冬酰胺酶的功能结构域上的关键残基进行了突变,成功将该酶在37°C下的热稳定性及比酶活分别提高了1.61倍和2.74倍。（3）将热裂解细胞和酶活测定进行同步,建立起适用于筛选高热稳定性、高酶活嗜热L-天冬酰胺酶的高通量筛选方法。对PYA基因进行两轮易错PCR（epPCR）构建突变文库,通过高通量筛选从6000个突变株中筛选出880个正向突变株,发现含有残基突变S17G、A90S、R156S、K272A的突变株分别占有效正突变株的31%,28%,39%,25%,远超过其他残基突变的概率,推测可能由于这些位点的突变导致酶活或热稳定性的提高。分别构建这些单点突变株,突变株PYA-S17G、PYA-R156S、PYA-K272A的比酶活分别提高到原始酶PYA的1.72、1.62、1.27倍,突变株PYA-A90S在85°C的半衰期(T（1/2,85°C）)延长了45分钟。这4个残基的复合突变株PYA-FH的比酶活提高到原始酶的2.1倍,且其T（1/2,85°C）从105分钟延长到145分钟。（4）通过筛选启动子将PYA基因在枯草芽孢杆菌168中的转录水平提高到原来的8.2倍,但酶活产量仅提高到原来的1.32倍,转录水平的提高和产量提高程度的不匹配可能是由于翻译水平低于原始菌所造成的。为此,我们利用RBS Calculator（https://www.denovodna.com/software/）构建了梯度初始转运速率（2,000到5,687,190 au）的300个RBS序列,并从中筛选出最适RBS序列,酶活表达量提高到原来的2.09倍。同时我们研究了PYA的分泌情况,通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现PYA在枯草芽孢杆菌中的分泌不依赖信号肽,而是通过非经典蛋白质分泌途径（non-classical protein secretion pathway）进行分泌。通过额外添加信号肽并进行筛选,发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SPphoD,并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高到原来的1.52倍。在此基础上,通过培养基优化、发酵过程控制,在5 L发酵罐上实现高产表达,使PYA酶活产量达到6324.23 U?mL-1,是目前报道的最高产量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 L-天冬酰胺酶概述
•     1.1.1 L天冬酰胺酶的来源及酶学性质
•     1.1.2 L-天冬酰胺酶的应用
•   1.2 L-天冬酰胺酶催化机制及分子改造
•     1.2.1 L-天冬酰胺酶的催化机制
•     1.2.2 L-天冬酰胺酶的分子改造
•   1.3 L-天冬酰胺酶的表达及发酵
•     1.3.1 L-天冬酰胺酶的野生菌发酵
•     1.3.2 L-天冬酰胺酶的重组菌发酵
•   1.4 枯草芽孢杆菌表达系统
•     1.4.1 枯草芽孢杆菌系统中蛋白的表达
•     1.4.2 枯草芽孢杆菌系统中蛋白的分泌途径
•   1.5 论文的选题背景及意义
•     1.5.1 立项依据及研究意义
•     1.5.2 主要研究内容
• 第二章 L-天冬酰胺酶来源筛选及酶学特性解析
•   2.1 引言
•   2.2 方法和材料
•     2.2.1 菌株及质粒
•     2.2.2 主要设备和相关培养基
•     2.2.3 L-天冬酰胺酶表达菌株的构建
•     2.2.4 L-天冬酰胺酶的表达及纯化
•     2.2.5 L-天冬酰胺酶酶学特性检测
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 L-天冬酰胺酶的异源表达
•     2.3.2 L-天冬酰胺酶的酶活测定及动力学参数分析
•     2.3.3 L-天冬酰胺酶最适温度及热稳定性分析
•     2.3.4 L-天冬酰胺酶的最适pH及 pH稳定性
•     2.3.5 金属离子及尿素对L-天冬酰胺酶的影响
•   2.4 本章小结
• 第三章 影响嗜热L-天冬酰胺酶热稳定性关键残基及功能结构域的解析
•   3.1 引言
•   3.2 材料和方法
•     3.2.1 质粒、菌种、试剂、培养基及仪器
•     3.2.2 重组菌的构建
•     3.2.3 蛋白的表达纯化及酶学特性分析
•     3.2.4 L-天冬酰胺酶同源性及氨基酸保守性分析
•     3.2.5 L-天冬酰胺酶的蛋白结构及分子动力学模拟
•   3.3 结果和分析
•     3.3.1 影响L-天冬酰胺酶热稳定性的关键氨基酸残基的预测
•     3.3.2 在P.yayanosii CH1L-天冬酰胺酶中验证关键残基
•     3.3.3 影响L-天冬酰胺酶热稳定性的关键二级结构域的预测
•     3.3.4 在P.yayanosii CH1L-天冬酰胺酶中验证关键二级结构域
•     3.3.5 在T.gammatolerans EJ3 L-天冬酰胺酶验证关键残基及结构域
•     3.3.6 在B.subtilis L-天冬酰胺酶中验证关键残基及结构域
•     3.3.7 在E.coli L-天冬酰胺酶中验证关键残基及结构域
•   3.4 本章小结
• 第四章 高酶活和热稳定的嗜热L-天冬酰胺酶突变株的改造
•   4.1 引言
•   4.2 材料和方法
•     4.2.1 质粒、菌种、试剂、培养基及仪器
•     4.2.2 L-天冬酰胺酶突变文库的构建
•     4.2.3 嗜热L-天冬酰胺酶高通量筛选方法的构建
•     4.2.4 重组菌的构建
•     4.2.5 L-天冬酰胺酶的表达、纯化及酶学特性测定
•     4.2.6 L-天冬酰胺酶的圆二色谱分析及蛋白结构模拟
•   4.3 结果和讨论
•     4.3.1 高酶活和热稳定性嗜热L-天冬酰胺酶高通量筛选方法的构建
•     4.3.2 PYA正突变株的筛选
•     4.3.3 PYA酶活关键残位点分析
•     4.3.4 PYA单突变结构分析
•     4.3.5 复合突变株的构建及酶学特性解析
•   4.4 本章小结
• 第五章 L-天冬酰胺酶的高产表达
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 质粒、菌种、试剂、培养基及仪器
•     5.2.2 重组菌的构建
•     5.2.3 基因转录水平的检测
•     5.2.4 不同强度RBS的设计及筛选
•     5.2.5 L-天冬酰胺酶发酵培养基优化
•     5.2.6 L-天冬酰胺酶的5L罐发酵
•   5.3 结果和讨论
•     5.3.1 启动子替换提高L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的表达水平
•     5.3.2 RBS筛选提高L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中表达水平
•     5.3.3 L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌能力的提高
•     5.3.4 L-天冬酰胺酶的培养基优化
•     5.3.5 L-天冬酰胺酶的发酵过程优化
•   5.4 本章小结
• 主要结论与展望
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录 Ⅰ：作者在攻读博士学位期间发表的论文与专利
• 附录 Ⅱ：合成的L-天冬酰胺酶基因序列

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李谞

导师: 饶志明

关键词: 天冬酰胺酶,热稳定性,高通量筛选,分子改造,高产表达

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ925

总页数: 107

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