舒孔亮1张燕2
（1长沙市第一医院神经内科410005；2中南大学湘雅二医院精神科410011）
重症肌无力（MyastheniaGravis，MG）是一种神经-肌肉接头处传递障碍的自身免疫性疾病，乙酰胆碱受体（acetylcholinereceptor，AChR）抗体是MG最主要的自身抗体。B淋巴细胞刺激因子（Blymphocytestimulator，BLyS）是新近发现的关于B细胞存活、活化的重要细胞因子，与免疫反应密切相关，我们观察了BLySmRNA在血清AChR抗体阳性MG患者的表达并分析了其与血清AChR抗体水平的关系，以探讨BLyS在MG发病中的地位和作用。
1资料与方法
1.1研究对象及分组：于2010年8月～2012年8月，收集在长沙市第一医院、中南大学湘雅二医院就诊、根据临床和辅助检查诊断为血清AChR抗体阳性MG患者35例为MG组，与入MG组病人年龄、性别相匹配的长沙市第一医院体检健康者19例为对照组。上述两组中有下列情况之一者已排除：①发病前3个月内曾使用激素或免疫抑制剂者。②伴有其他自身免疫性疾病者。两组研究对象年龄、性别无统计学差异。见表1。
表1研究对象一般资料
1.2试验方法：取MG患者和正常对照者肘静脉血10ml。7ml静脉血肝素（50u/ml静脉血）抗凝，摇匀，用于分离单个核细胞。3ml静脉血不抗凝，室温下凝固后分离血清，－20℃下冷冻保存备用。选用Ficoll分层液法，即一种单次密度梯度离心分离法，分离得到单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞）。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测MG组和对照组外周静脉血单个核细胞BLySmRNA的表达。BlyS和β-actin引物参考PascalSchneider等人的文献[1]，由上海博亚生物技术有限公司合成。其序列，产物长度及实验时的退火温度见表2，PCR反应体系为25μl同管扩增，PCR反应条件：①预变性：95℃，5分钟②变性：94℃，1分钟③退火：温度见表2，1分钟④延伸：72℃，1分钟，②～④共30个循环,72℃终末延伸10分钟。用间接ELISA法检测MG患者血清AChR抗体IgG型，AChR由美国德州大学医学院Christados教授惠赠，包被时将纯化的AChR用PH值9.6的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释到0.5ug/ml。检测时每份血清稀释100倍，HRP-羊抗人IgG抗体稀释1000倍，以有无显色反应判断结果的阴、阳性，用酶标仪读取450nm/630nm处的OD值。
表2PCR引物序列、产物长度及实验时的退火温度
1.3统计处理：本实验测定的计量资料数值用均数±标准差（x-±s）表示。两个独立样本均数间的比较用成组t检验，双变量正态分布的两变量间的相关性分析用Bivariatecorrelate检验。以P值＜0.05为差异有显著性。所有数据使用SPSS11.5软件进行统计分析。
2结果
2.1BLySmRNA在MG组、正常对照组中的表达水平比较
实验发现（见表3），BLySmRNA在MG组单个核细胞的表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。正常对照组中有少量表达。数据表明BLySmRNA在MG组中的表达上调。
表3MG组、正常对照组间BLySmRNA表达水平比较（x-±s）
注：△与正常对照组比较P＜0.01
2.2MG患者BLySmRNA表达水平与IgG型AChR抗体水平相关性分析
对MG组外周血单个核细胞BLySmRNA表达、血清IgG型AChR抗体水平进行相关性分析（见表4）。结果发现，外周血单个核细胞BLySmRNA表达与血清IgG型AChR抗体水平呈正相关(P＜0.01)。
表4MG组BLySmRNA表达水平与AChR抗体水平相关性分析
注：※MG组BLySmRNA表达水平与AChR抗体水平相关系数，P＜0.01
3讨论
BLyS又称BAFF(BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily)，或TALL-1(TNF-andAPOL-relatedleukocyteexpressedligand1)，THANK(TNFhomologthatactivatesapoptosis,NFKBandJNK)，zTNF4，属肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，于1999年由几个小组几乎同时发现[2,1，3，4]，它主要作用于B细胞，为B细胞的发育、分化、成熟提供生存信号。在BLyS缺陷鼠，外周B细胞的发育停滞于T1-B细胞（transitionaltypeⅠBcell）阶段[5,6]，不能继续发育成熟；给与外源性BLyS或BLyS过量表达，成熟B细胞的数目明显增加[1,3,7]。
本研究发现血清AChR抗体阳性MG患者外周血单个核细胞BLySmRNA的表达较正常人升高，该表达升高可能与其免疫系统稳态的破坏有关。研究发现BLyS有两个不同的来源，一个是由抗辐射细胞（可能是淋巴样器官的基质细胞）持续的以固定量生产的BLyS池[8,9]；另一个是由细胞因子诱导的由骨髓起源的细胞如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞局部产生的BLyS附加池，许多炎性细胞因子，特别是干扰素γ和白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）能上调BLyS的表达[10]，由细胞因子诱导的BLyS池能使额外的B细胞在局部如炎症部位暂时的积聚[8，9,11-14]。实验表明骨髓起源的细胞不是BLyS的主要来源[8]。基于这些我们认为由于MG患者AChR的自身耐受被打破，启动了针对自身抗原的免疫应答，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞作为抗原呈递细胞参与免疫应答反应，在免疫应答过程中增殖、活化。同时IL-10等细胞因子在MG患者的自身免疫应答过程中的表达也上升，从而诱导激活的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生更多BLyS，造成了MG患者BLyS表达的过量。
本研究发现血清AChR抗体阳性MG患者外周血单个核细胞BLySmRNA的表达与血清IgG型AChR抗体水平呈正相关，其原因可能与以下几方面相关：①BLyS影响自身反应性B细胞:自身反应性B细胞是直接产生自身抗体的淋巴细胞，在自身免疫性疾病中起重要作用，Thien等[15]研究发现，过量的BLyS对自身反应性B细胞的正常清除有挽救作用，当BLyS过量时可能有一些自身反应性B细胞由于环境中生存信号水平的增强而存活。②BLyS和长寿浆细胞及记忆B细胞：Avery等[16]所作的体外研究发现BLyS通过抗凋亡作用选择性的增强由记忆B细胞转化的浆细胞的存活。③BLyS影响B细胞表面CD分子：已有研究发现BLyS刺激增强了CD19和CD21的表达[17]，[18]。CD19和CD21是B细胞共受体的一部分，它们与CD81一起与BCR交联可以降低B细胞活化的阈值[19]。
我们设想在血清AChR抗体阳性MG患者，当AChR的自身耐受被打破后，在细胞因子的诱导下BLyS附加池产生更多BLyS，形成了BLyS表达的过量，一方面造成外周成熟B细胞数量增多，增加了针对自身抗原免疫的机会；另一方面产生更多的AChR抗体，增加了针对神经肌肉接头处免疫侵袭的强度；并且BLyS的过量表达有可能形成恶性循环，从而导致疾病持续进行甚至加重。
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