基于生物学过程分析的金黄色葡萄生物被膜行为的转录机制研究

论文摘要

在众多食品安全问题中,微生物及其生物被膜引发的食品污染在国际上被公认为首要问题。微生物在自然界及人工环境中有两种生存策略,游离态与生物被膜,生物被膜中又存在单菌种生物被膜及混合生物被膜两种方式。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,以下简称“金葡菌”）是常见的食源性致病微生物,具有流行广、形成被膜能力强、耐药性强和致病性强等特点。目前缺乏对金葡菌游离态、单菌种生物被膜及混合生物被膜三大生存策略的研究。而对上述三大策略中各自的调控机制是治理金葡菌引发的污染的前提和关键。本课题从食品管道流动环境出发,采用模拟流体模型,从转录水平探究金葡菌在游离态、单菌种生物被膜及混合生物被膜（选取食品发酵真菌假丝酵母）三大生存策略中所共享及特有的调控机制。（一）金葡菌生物被膜流体模型的建立及分析方法建立金葡菌单菌种生物被膜培养的流体模型,并对金葡菌游离态增殖及单菌种生物被膜形成过程进行阶段性细化,生物被膜分为初期粘附期（8 h）、成熟期（2 d）及脱落分化期（14 d）,游离态则分为早对数期（2 h）、晚对数期（6 h）及平台期（2 d）;同时建立金葡菌与假丝酵母体外生物被膜模型。使用微阵列技术,对游离态及生物被膜态的MRSA USA300株进行全局转录情况分析,注释后富集至细胞增殖代谢、TCS、生物被膜形成、耐药性及毒力因子五种生物学过程亚类中。（二）金葡菌生物被膜不同形成阶段的特征金葡菌单菌种生物被膜处于初期粘附期时,金葡菌高效摄取培养环境中的葡萄糖,并显著下调胞内以次级代谢产物为碳源的水解供能强度至游离态的30%;积累丙氨酸、谷氨酸并增加对环境中Fe和Na+的主动摄入;激活lytSR介导的“程序性”自溶,促进对基底的粘附;下调LuxS系统降低荚膜多糖75%的主动合成水平,此时胞外基质以Pls、FnBPs和及PIA为主;此时生物被膜表现出对四环素、磷霉素的耐药性并上调γ-溶血素、凝固酶、白细胞毒素LukD及A型肠毒素的合成。金葡菌单菌种生物被膜处于成熟期时,金葡菌间对氧气产生竞争,以糖酵解途径分解碳源,激活HrcA-DnaK调节通路应对菌群温度变化;积累丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸,同时激活QS系统,通过激活agr操纵子和epiB的表达控制菌群密度;上调saeRS、srrAB并下调arlRS操纵子表达,增强生物被膜对基底的粘附性;ClfB及荚膜多糖合成水平恢复至接近游离态金葡菌的合成水平;下调毒力因子及耐药相关蛋白合成水平。金葡菌单菌种生物被膜处于脱落分化时,残留的粘附态金葡中,增加对环境中多肽的主动摄取,同时体内继续积累谷氨酸、丙氨酸及天冬氨酸;胞外基质成分以ClfB、荚膜多糖及PIA为主,主动下调80%的FnBPs的合成水平（相对初期粘附期及成熟期）;提高了胞内对耐药、毒力因子的整合重组效率,上调流产感染蛋白、I型肠毒素、1型/5型外毒素的合成水平。此外,在金葡菌单菌种生物被膜形成过程中,agr系统调控的FnBPs和LuxS系统调控的荚膜多糖的有一定的“互补代偿”作用,维持生物被膜结构稳定。（三）金葡菌与假丝酵母混合生物被膜中金葡菌的生长特征6.在金葡菌与假丝酵母形成的混合生物被膜中,相对于单菌种生物被膜,金葡菌通过PEP:PTS系统摄入碳源,以半乳糖醇、N-乙酰胞壁酸及海藻糖等代谢产物为主,降低约80%的葡萄糖摄入;Atl及CidAB诱导的自溶水平及Fts家族蛋白诱导的分裂过程旺盛,相关基因上调超过400%,多糖基质核心PIA合成受抑制,形成FnBPs依赖型生物被膜;下调70%β-内酰胺类抗生素耐药基因的表达水平,上调溶血素、杀白细胞毒素、肠毒素及特异性免疫显性抗原合成水平。综上,无论是在金葡菌的单菌种生物被膜及金葡菌与假丝酵母形成的混合生物被膜中,金葡菌通过主动调节摄入的环境碳源种类、调节体内多种氨基酸代谢及合成水平、激活TCS系统控制种群密度、调节agr-LuxS系统调控的生物被膜基质合成以及采取不同的毒素分泌和耐药策略,维持生物被膜对基底的粘附性及自身的稳定性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 食品加工与微生物污染
•     1.1.1 食品管道加工环境中的微生物安全隐患
•     1.1.2 细菌的增殖生存方式
•   1.2 金葡菌与食物中毒
•     1.2.1 金葡菌概况
•     1.2.2 金葡菌引发的细菌性食物中毒
•   1.3 金葡菌生物被膜
•     1.3.1 能量代谢及物质摄入系统
•     1.3.2 金葡菌生物被膜形成过程及主要组分功能
•     1.3.3 金葡菌生物被膜TCS调控系统
•     1.3.4 抗生素残留及耐药性
•     1.3.5 金葡菌与假丝酵母混合生物被膜
•   1.4 本课题的研究背景、意义和内容
•     1.4.1 本课题的研究背景和意义
•     1.4.2 主要研究内容
• 第二章 游离态及生物被膜金葡菌核心差异调控策略分析
•   2.1 前言
•   2.2 实验材料与设备
•     2.2.1 实验菌株
•     2.2.2 实验试剂
•     2.2.3 实验设备
•     2.2.4 培养基和常用溶液的配制
•   2.3 实验过程与方法
•     2.3.1 金葡菌的复苏及菌液制备
•     2.3.2 金葡菌生物被膜粘附与脱落状态菌体的培养
•       2.3.2.1 金葡菌生物被膜粘附与脱落状态体外模型的构建
•       2.3.2.2 金葡菌生物被膜粘附与脱落状态菌体的培养和收集
•     2.3.3 微阵列技术分析不同状态金葡菌的转录差异
•       2.3.3.1 微阵列（基因芯片）制备
•       2.3.3.2 RNA提取
•       2.3.3.3 琼脂糖电泳
•       2.3.3.4 RT反转录及Cy标记
•       2.3.3.5 扫描及数据分析
•     2.3.4 游离态及生物被膜金葡菌体内表达水平相近及显著差异基因的筛选
•   2.4 实验结果及讨论
•     2.4.1 RNA提取结果
•     2.4.2 微阵列数据注释及基因富集
•     2.4.3 生物被膜状态及游离态金葡菌转录差异基因分析
•       2.4.3.1 游离态及生物被膜金葡菌体内表达水平差异显著基因的分布
•       2.4.3.2 初期粘附期生物被膜金葡菌体内特异性显著表达基因分析
•     2.4.3.2.1 初期粘附期生物被膜相较早期对数游离态金葡菌转录特性
•     2.4.3.2.2 初期粘附期生物被膜相较晚期对数游离态金葡菌转录特性
•     2.4.3.2.3 初期粘附期生物被膜相较平台期游离态金葡菌转录特性
•       2.4.3.3 成熟期期生物被膜金葡菌体内特异性显著表达基因分析
•     2.4.3.3.1 成熟期生物被膜相较早期对数游离态金葡菌转录特性
•     2.4.3.3.2 成熟期生物被膜相较晚期对数游离态金葡菌转录特性
•     2.4.3.3.3 成熟期生物被膜相较平台期游离态金葡菌转录特性
•       2.4.3.4 脱落分化期生物被膜金葡菌体内特异性显著表达基因分析
•     2.4.3.4.1 脱落分化期生物被膜相较早期对数游离态金葡菌转录特性
•     2.4.3.4.2 脱落分化期生物被膜相较晚期对数游离态金葡菌转录特性
•     2.4.3.4.3 脱落分化期生物被膜相较平台期游离态金葡菌转录特性
•     2.4.4 生物被膜状态相较游离态金葡菌的转录策略分析
•       2.4.4.1 初期粘附期生物被膜相较游离态金葡菌转录策略分析
•       2.4.4.2 成熟期期生物被膜相较游离态金葡菌转录策略分析
•       2.4.4.3 脱落分化期生物被膜相较游离态金葡菌转录策略分析
•   2.5 本章小结
• 第三章 流体模型中金葡菌生物被膜形成全过程调控机制
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料与设备
•     3.2.1 实验菌株
•     3.2.2 实验试剂
•     3.2.3 实验设备
•     3.2.4 培养基和常用溶液的配制
•   3.3 实验过程与方法
•     3.3.1 金葡菌的复苏及菌液制备
•     3.3.2 金葡菌生物被膜粘附与脱落状态菌体的培养
•     3.3.3 微阵列技术分析不同状态金葡菌的转录差异
•     3.3.4 生物被膜金葡菌体内核心调控系统的动态分析
•   3.4 实验结果及讨论
•     3.4.1 RNA提取结果
•     3.4.2 微阵列数据分析
•       3.4.2.1 生物被膜金葡菌体内核心调控系统的筛选
•       3.4.2.2 生物被膜中金葡菌体内累积氨基酸并影响TCA循环
•       3.4.2.3 金葡菌TCS系统及其对生物被膜形成的调控
•     3.4.2.3.1 调控细胞自溶的lytSR及 lrgAB
•     3.4.2.3.2 saeRS、arlRS及 srrAB
•     3.4.2.3.3 生物被膜核心调控agr及 LuxS系统
•     3.4.2.3.4 生物被膜基质的“互补代偿”现象
•       3.4.2.4 生物被膜中金葡菌耐药和毒性特征
•     3.4.3 流体模型中金葡菌单菌种生物被膜策略及调控机制
•   3.5 本章小结
• 第四章 混合生物被膜中金葡菌的生长特性
•   4.1 前言
•   4.2 实验材料与设备
•     4.2.1 实验菌株
•     4.2.2 实验试剂材料及常用溶液配置
•     4.2.3 实验设备
•   4.3 实验过程与方法
•     4.3.1 金葡菌的复苏及菌液制备
•     4.3.2 假丝酵母的复苏及菌液制备
•     4.3.3 金葡菌-假丝酵母混合生物被膜培养
•     4.3.4 微阵列技术分析混合生物被膜中金葡菌转录情况
•   4.4 实验结果及讨论
•     4.4.1 混合生物被膜中金葡菌的增殖和代谢
•       4.4.1.1 细胞分裂及离子转运
•       4.4.1.2 氨基酸水解
•       4.4.1.3 PEP:PTS碳水化合物主动摄入系统
•     4.4.2 混合生物被膜中金葡菌形成FnBPs依赖型生物被膜
•     4.4.3 混合生物被膜中金葡菌的耐药及致毒特性
•       4.4.3.1 金葡菌β-内酰胺类抗生素耐药基因表达下调
•       4.4.3.2 金葡菌大量合成分泌型毒力因子
•     4.4.4 混合生物被膜中金葡菌的生存机制
•   4.5 本章小结
• 结论与展望
•   一、结论
•   二、主要创新点
•   三、展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 苗健

导师: 徐振波

关键词: 金黄色葡萄球菌,生物被膜,微阵列转录分析,白色假丝酵母

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 华南理工大学

基金: 国家“十三五”重点研发计划项目课题(2016YFD0401202-1)

分类号: TS201.3

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.001609

总页数: 144

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