温敏阻遏蛋白论文_沈国妙

导读:本文包含了温敏阻遏蛋白论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白,突变,论文,技术,DNA,CI。

温敏阻遏蛋白论文文献综述

沈国妙^[1]（2003）在《利用DNA改组技术产生λ噬菌体CI温敏阻遏蛋白》一文中研究指出λ噬菌体CI阻遏蛋白在控制噬菌体的溶源裂解途径中扮演着重要的角色。通过经典的遗传学方法，已经分离得到几个温敏阻遏蛋白，其中包含有最有名的CIts857 温敏阻遏蛋白。在基因工程中，由λ噬菌体P_L、P_R 强启动子和温敏蛋白CIts857 构成的表达系统常用来调控外源基因的表达。把培养温度从30℃提升到42℃，能够使CIts857温敏蛋白失活，从而诱导外源基因的表达。研究发现大肠杆菌在温度上升到40℃以后，由于热击产生的蛋白水解酶会显着地加快外源蛋白的分解。而低于40℃时，温敏表达系统调节外源基因的表达效率较低。大肠杆菌的正常生理条件是37℃，我们希望获得在此温度下就具有良好温敏特性的阻遏蛋白。DNA改组技术是一项有效的体外突变重组技术，该技术在对序列相关的基因发生重组的同时，也可引入一定数量的点突变。本实验首次应用 DNA改组技术，对野生型CI阻遏蛋白进行体外分子进化，获得了在37℃下温敏诱导效果比CIts857好的5个突变体。实验内容与结果如下： 1．功能性克隆cI基因和 cIts857 基因以野生型λ噬菌体和温敏突变体λcIts857 基因组为模板，用PCR扩增cI和cIts857 基因。酶切后插入含有 LacZ 作为报告基因的原核表达载体 pYPX4062(Genbank No：AY178451)。通过观察克隆颜色的变化和DNA测序验证，构建了含有cI和cIts857基因活性表达的质粒pYPX4062-cI和pYPX4062-cIts857。 2．利用DNA改组技术获得突变的cI基因从质粒pYPX4062-cI中用PCR扩增获得cI基因，优化DNA改组程序，获得突变的cI基因，酶切后插入到表达载体pYPX4062。 3．突变质粒库的构建和筛选采用电击转化法将连接物转入大肠杆菌lacZ缺陷型菌株构建突变质粒文库，库容为1.04×10~6。通过筛选，获得132个具有温敏表型的克隆。与cIts857比较后，选出5个表型最显着的克隆，编号为cIts6，cIts14，cIts81，cIts85以及cIts107。β-半乳糖苷酶测活结果显示，这些克隆在37℃下的诱导效果分别为cIts857的1.38，3.77，5.12，3.35和1.61倍。 4．DNA序列的测定和分析浙江大学硕士学位论文对上述5个克隆进行了DNA序列测定，结果表明clts6有3处核普酸发生突变，分别为幻7q倪59e，Tso6e:cltsl4有两处发生突变，分别为A199G，A6oZG;cltssl有4处发生突变，分别为A啊G，G92A，G379A，A629T;clts85只有一处突变为C188T，cltsl07有3处发生突变，为G160A，A488G，T56lC。13个突变中只有一个为同义突变，没有引起相应的氨基酸改变。得到的每一个克隆均有突变发生在阻遏蛋白的N端，其中199位上的突变与clts857的突变相同，188位上的突变与另一温敏突变株CltSU46一致，但氨基酸不同。(本文来源于《浙江大学》期刊2003-06-01）