猪圆环病毒3型巢式PCR检测方法的建立及应用

论文摘要

猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是一种新的圆环病毒,可引起猪的皮炎和肾病综合征、繁殖障碍及多系统炎症等,最初于2016年在美国被发现,随后在韩国、巴西、意大利、波兰等国家陆续报道。近两年来,PCV3已在我国多个省市被发现且感染范围越来越广泛,对养猪业构成的潜在威胁已不容忽视。然而,针对PCV3的研究尚处于起步阶段,要了解该病毒在猪群中的感染与传播情况,及时监测和分析是首要的步骤。因此,建立准确而快速的检测方法将有助于有效控制PCV3的传播,特别是将该方法用于临床病例的监测及种猪贸易检验检疫。本研究通过PCV3巢式PCR检测方法的建立和应用,旨在为监测安徽地区猪群中PCV3的感染情况,进而为深入开展PCV3的流行病学等研究提供技术支撑。1、PCV3巢式PCR检测方法的建立本研究根据GenBank中登录的PCV3全基因序列（登录号:MF084994）设计内、外2对巢式PCR特异性引物,并通过以下试验建立PCV3巢式PCR检测方法:（1）设置 54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃和 60℃7 组不同的退火温度进行退火温度的筛选以及通过对第一轮PCR扩增产物按100倍、50倍、10倍3个稀释倍数进行稀释作为第二轮PCR模板进行PCR反应条件的优化试验。（2）利用建立的该方法对PCV3与猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）5种常见病毒的检测进行特异性试验。（3）利用建立的该方法与普通PCR方法同时对（10-10～10-1）不同稀释度标准质粒的检测进行灵敏性试验。（4）通过对10-8、10-9、10-10拷贝/uL浓度标准质粒的批间和批内检测对建立的该方法进行重复性试验。（5）利用建立的该方法与商品化PCV3实时荧光PCR检测试剂盒同步检测临床收集的血清样品,使用Kappa分析比较两种方法的检测结果进行符合率验证。结果显示:（1）58℃为本研究建立的PCV3巢式PCR的最佳退火温度,当一扩产物作50倍稀释进行二扩获得的扩增结果最好。（2）除PCV3扩增出预期的目的条带外,PCV2、CSFV、PRV、PRRSV、PEDV 5种病毒均无目的条带出现。（3）该方法的最低检测限为1.74×10拷贝/μL,较普通PCR的灵敏度高105倍。（4）10-8和10-9拷贝/uL的标准品模板平行样品均有目的条带的出现,但模板浓度为10-10拷贝/uL时,3份平行样品均无目的条带;10-8、10-9拷贝/uL的标准品模板3次试验均出现目的条带,但模板浓度为10-10拷贝/uL时3次均无目的条带。（5）本研究建立的巢式PCR方法与商品化PCV3实时荧光PCR检测试剂盒同步检测78份血清样品,PCV3的阳性率分别为30.77%和33.33%,两种方法检测结果的Kappa分析系数为0.94,一致性较好。2、PCV3巢式PCR检测方法的应用应用本研究建立的PCV3巢式PCR检测方法对源自安徽15个地市528份不同临床样品进行PCV3的检测。并通过SPSS 22.0软件对不同样品来源、不同临床症状、不同生长阶段以及不同类型样品中PCV3的阳性率进行数据处理,采用卡方检验进行数据分析。结果显示:安徽15个地市528份临床样品中PCV3总阳性检出率为20.45%,其中12个地市均存在PCV3的感染现象。在临床表现为呼吸道疾病、繁殖障碍、神经症状、腹泻、高热、急性死亡、消瘦的猪群中均检出PCV3,阳性检出率在5.00%～44.44%之间,无显著性差异;不同生长阶段的猪（哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、母猪、死胎）均存在PCV3感染,阳性检出率分别为14.52%、19.35%、25.42%、29.69%、24.24%,差异不显著;PCV3在病料组织混样、血清及粪便中的检出率分别为18.72%、33.33%、12.50%,其中血清样品的阳性检出率显著高于组织混样;PCV3在猪的脑、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结中的检出率分别为21.21%、23.33%、26.67%、20.18%、31.25%、47.83%,其中PCV3在淋巴结中的检出率显著高于脾脏。综上结果表明:（1）本研究建立的PCV3巢式PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于临床样品的检测。（2）安徽大部分地区均存在PCV3感染;PCV3与猪呼吸道疾病、繁殖障碍、神经症状、腹泻、高热、急性死亡等疾病的发生存在一定的关联;各生长阶段的猪均可感染PCV3;血清样品中PCV3的阳性检出率高于组织混样;PCV3可分布于不同的组织器官中,淋巴结的阳性检出率最高。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 主要缩略语对照表
• 文献综述
• 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 试验毒株
•     1.1.2 临床样品
•     1.1.3 试剂盒、培养基及主要试剂
•     1.1.4 主要仪器
•     1.1.5 主要试剂及培养基配制
•   1.2 方法
•     1.2.1 样品的处理
•     1.2.2 病毒核酸的提取
•     1.2.3 PCV3巢式PCR检测方法的建立
•     1.2.4 PCV3巢式PCR检测方法的应用
• 2 结果
•   2.1 PCV3巢式PCR检测方法的建立
•     2.1.1 重组质粒标准品的制备
•     2.1.2 退火温度的优化
•     2.1.3 稀释比例的优化
•     2.1.4 特异性试验
•     2.1.5 灵敏性试验
•     2.1.6 重复性试验
•     2.1.7 符合率检测
•   2.2 PCV3巢式PCR检测方法的应用
•     2.2.1 不同地区PCV3的检测结果
•     2.2.2 不同临床症状PCV3的检测结果
•     2.2.3 不同生长阶段PCV3的检测结果
•     2.2.4 不同类型样品PCV3的检测结果
• 3 讨论
•   3.1 PCV3巢式PCR检测方法的建立
•   3.2 PCV3巢式PCR检测方法的应用
•     3.2.1 不同地区PCV3检测结果分析
•     3.2.2 不同临床症状PCV3检测结果分析
•     3.2.3 不同生长阶段PCV3检测结果分析
•     3.2.4 不同类型样品PCV3检测结果分析
• 4 结论
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张静

导师: 李郁,何长生

关键词: 猪圆环病毒型,巢式,建立,应用,安徽

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 安徽农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000181

总页数: 59

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