导读:本文包含了重组尿素酶亚单位论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:幽门,尿素,螺杆,单位,疫苗,基因,免疫。
重组尿素酶亚单位论文文献综述
高志刚,邹全明,刘凤英,曹向光[1]（2007）在《重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位鼻腔免疫凝胶剂的研制》一文中研究指出目的研制重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗凝胶剂,考察其特性及免疫效果。方法以卡泊波为基质,脱氧胆酸钠为黏膜吸收促进剂,制备凝胶剂,以落球法测定凝胶的黏度,SDS-PAGE电泳分析脱氧胆酸钠对蛋白纯度的影响,以免疫印记检测疫苗蛋白的完整性,以留样观察法及离心法考察凝胶的稳定性,以含抗原凝胶剂鼻腔免疫BALB/c小鼠,并与溶液剂相比较,考察凝胶剂的免疫效果。结果制备的凝胶剂稳定性好,凝胶的黏度为8050mPa.s,脱氧胆酸钠不影响蛋白的纯度,抗原蛋白的完整性良好。小鼠鼻腔免疫凝胶剂后产生了较强的特异性血清IgG及胃肠sIgA反应,优于液体免疫。结论重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位凝胶剂性质稳定,具有生物黏附性,可提高免疫效果,是较好的鼻腔免疫剂型。(本文来源于《中国现代应用药学》期刊2007年06期）
王缚鲲[2]（2007）在《重组人抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位sIgA分子的构建表达及特性研究》一文中研究指出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)为一种革兰阴性细菌,是人类慢性活动性胃炎和消化溃疡的重要原因,被确认是胃癌和胃淋巴样组织淋巴瘤的危险因子。Hp感染与社会经济状况密切相关,在许多发展中国家其感染率超过50%,在发达国家达40%。Hp感染后若不采取特殊治疗措施常常为终身带菌。由于胃内的高酸性对抗生素有较大影响,所以,这些抗生素往往要与质子泵抑制剂和雷尼替丁枸橼酸铋同时使用。虽然组合抗生素方法对于治疗Hp感染是有效的,但是研制一种有效的疫苗将会更有益处,特别是在胃癌发病率高、感染复发率大和抗生素耐药性不断增高的国家。实验证明疫苗疗法对于Hp感染动物模型是相当成功的,然而在此基础上研制一种人类预防或治疗性疫苗仍然是非常困难的。采用众多候选疫苗进行的大量临床试验表明其效力较差。人类在通过口服抗体治疗和预防Hp方面也进行了许多尝试,实验证明口服抗尿素酶IgA单克隆抗体可保护小鼠不受猫胃螺杆菌(Helicobacter felis)感染。另有实验证实sIgA在儿童期防止消化道Hp感染中起着重要的作用,母乳中的IgA被摄入后能在消化道粘膜表面清除外来微生物或随食物吞咽下的抗原。Tharas在冈比亚的研究发现,生后第一年未感染幽门螺杆菌的婴儿的母乳其特异性sIgA滴度较感染婴儿的母乳中高2～4倍,表明了母乳通过抗体依赖机制在防止幽门螺杆菌感染上起重要作用,尤其是Hp感染的母亲其高浓度的特异性sIgA能大大延迟婴儿的幽门螺杆菌感染,而第二年以后的感染可能与母婴的密切接触以及断乳有关。以上实验说明特异性抗Hp sIgA在预防和治疗Hp感染方面具有重要作用。然而,单克隆抗体为鼠源且不能大规模生产,而从母乳中提取足量的sIgA分子也不现实。所以,有必要通过抗体工程技术获得大量特异性针对Hp的sIgA分子。1994年,Michette et al.首次利用纯化的Hp尿素酶作为抗原免疫小鼠,显示对猫螺杆菌(Hf)感染有良好的保护作用,分别口服Hp尿素酶(全部结构)或其A亚单位、B亚单位,再加上霍乱毒素(CT)作为佐剂,结果证明了起保护作用的是B亚单位(UreB)。另有许多实验证明,Hp UreB能够作为口服疫苗用于预防和治疗Hp感染。所以,我们决定构建抗Hp UreB sIgA分子。主要研究结果如下:1.抗Hp噬菌体单链抗体库的构建和筛选首先检测献血员抗Hp和rUreB抗体,分离阳性者外周血淋巴细胞,提取总RNA并等量混合。利用RT-PCR扩增全套重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,分子量分别约为400bp和350bp。将VH和VL纯化后采用overlap方法连接,插入噬菌体载体pComb3x构建成库容量为4.6 x 10~8的单链抗体噬菌体库。以纯化rUreB为靶标包被96孔板,用3%BSA封闭液封闭,加入噬菌体孵育后,用洗脱液冲洗5次进行筛选。之后的筛选逐渐降低rUreB包被浓度,并增加冲洗次数。在5轮筛选之后,获得与rUreB发生反应的41个克隆,最强的克隆命名为scFv1,通过免疫印迹的方法证明,scFv1仅与rUreB和Hp菌株反应,不与非Hp菌株反应,因此,将scFv1送出测序。2.表达载体pcDNA3.1(+):HSVHCα1和pcDNA3.1(+):LSVLCλ2的构建首先分离人外周血中性粒细胞并提取RNA,采用RT-PCR的方法获得人IgA1重链恒定区(Cα1)基因,该片段分别含有EcoRI和XbaI酶切位点。重链信号肽编码序列是通过引物之间重迭延伸的方法获得的。该序列与VH片段的连接采用overlap的方法,连接物含有HindIII和EcoRI酶切位点。表达载体pcDNA3.1(+):HSVHCα1是通过叁个部分连接而成:(i)经HindIII /XbaI酶切的质粒pcDNA3.1(+), (ii)经HindIII/ EcoRI处理的重链信号肽编码序列与VH片段的连接物,(iii)经EcoRI/ XbaI消化的Cα1基因。轻链恒定区(Cλ2)编码序列是从人脾细胞基因组DNA通过PCR获得的,该片段含有EcoRI和NotI酶切位点。轻链信号肽编码序列的获得采用与重链信号肽相同的方法。该序列与VL片段的连接同样采用overlap的方法,连接物引入HindIII和EcoRI两个酶切位点。表达载体pcDNA3.1(+):LSVLCλ_2同样由叁部分装配而成:(i)经HindIII /NotI酶切的质粒pcDNA3.1(+), (ii)经HindIII/ EcoRI处理的轻链信号肽编码序列与VL片段的连接物,(iii)经EcoRI /NotI消化的Cλ2基因。3.表达载体pcDNA3.1(+)Hyg:J Chain和pcDNA3.1(-)Bsd:SC的构建首先用SmaI和Bpu14I处理质粒pcDNA3.1 (+)以切除neoR抗性基因。hygR抗性基因是以质粒pMEP4 (Invitrogen)为模板通过PCR的方法获得的,分子量大约为1.1 kb,并且含有SmaI和Bpu14I酶切位点。用SmaI和Bpu14I酶切PCR产物后,与切除neoR抗性基因的pcDNA3.1(+)连接产生质粒pcDNA3.1(+)Hyg。人J链编码序列是以人脾细胞RNA为模板通过RT-PCR获得的,分子量大约为430bp,含有HindIII和NotI酶切位点。用HindIII和NotI处理RT-PCR产物和pcDNA3.1(+)Hyg后,将二者相连形成表达载体pcDNA3.1(+)Hyg:Jchain。分泌片(Secretory component,SC)的编码序列是采用RT-PCR方法从人结肠腺癌HT29细胞中获得的,含有HindIII和XbaI两个酶切位点。用HindIII和XbaI处理RT-PCR产物和质粒pcDNA3.1(-)Bsd,然后将二者相连形成表达载体pcDNA3.1(-)Bsd:SC。4.稳定表达特异性针对Hp UreB sIgA的CHO细胞的筛选首先用含有小牛血清、Hepes(pH 7.0)、青霉素和链霉素的IMDM培养CHO细胞。对1×107CHO细胞进行电穿孔,用ScaI-线性化的pcDNA3.1(+):HSVHCα1和BglII-线性化的pcDNA3.1(+):LSVLCλ2转染CHO细胞。24 h后用500μg/ml G418开始筛选,连续进行3周。挑取单克隆于96孔板,dot-ELISA法检测细胞培养上清。对表达最大量IgA1的克隆(Clone1)进行扩大培养,用BglII–线性化的pcDNA3.1(+)Hyg:Jchain进行电转染。在500μg/ml G418和400μg/ml潮霉素同时存在的条件下筛选,从而获得了表达最大量dIgA的克隆(Clone 2)。对1×107CHO细胞进行电穿孔,然后用BglII-线性化的pcDNA3.1(-)Bsd:SC进行转染。24 h后用10μg/ml杀稻瘟菌素开始筛选,连续进行3周。挑取单克隆于96孔板,dot-ELISA法检测细胞培养上清,获得表达最大量dIgA的克隆(Clone 3)。将Clone 2和Clone 3细胞培养上清浓缩,37℃作用2h。这样,通过dIgA和SC结合我们得到sIgA分子。sIgA的特异性通过免疫印迹的方法证明,sIgA仅与rUreB和Hp菌株反应,不与非Hp菌株反应。另外,Hp菌株与sIgA作用后,其粘附胃上皮细胞GES-1的能力大大减弱,证明sIgA具有阻断Hp粘附胃上皮细胞的作用。总之,我们通过实验证明了可在异种哺乳细胞中生产人sIgA全分子,而且特异性针对Hp UreB sIgA可以阻断Hp粘附胃上皮细胞GES-1。我们的数据说明sIgA可能会成为抗生素治疗无效患者的替代或者补充治疗方法。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2007-05-01）
杨兴龙,何跃忠,张敬东,钟东,刘宇虎[3]（2005）在《Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒菌重组疫苗的制备和生物效应研究》一文中研究指出目的研制表达幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗,并观察其生物学效应。方法以幽门螺杆菌标准株——悉尼株(SS1)的基因组DNA为模板,构建Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB。经口服免疫BALB/c小鼠后,检测肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体,同时观察小鼠体重、胃黏膜炎症程度等一般情况。结果构建Hp-UreB的SL3261/pTC01-UreB菌株,连续传80代可稳定表达Hp-UreB,菌落提取质粒后酶切及PCR鉴定均与pTC01-UreB符合;SDS-PAGE和Western blot显示pTC01-UreB转化SL3261可表达与Hp-UreB亚单位相符的相对分子质量约61000蛋白,该蛋白能与抗Hp兔血清反应;SL3261/pTC01-UreB口服免疫BALB/c小鼠的肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体明显增高,而小鼠体重和胃粘膜炎症指数与对照组差异无显着意义。结论Hp-UreB的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB口服免疫小鼠可诱导特异性免疫应答。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2005年05期）
徐灿,李兆申,屠振兴,杜奕奇,龚燕芳[4]（2005）在《携带幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的构建》一文中研究指出目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(ureB)基因重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术从基因组DNA扩增ureB基因,克隆入pUCmT载体,检测ureB基因序列,经过酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定。重组载体pIRES ureB转入减毒鼠伤寒沙门菌LB5000,抽提质粒,再次转入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES ureB转染COS 7细胞,SDS PAGE Western 印迹法检测pIRES ureB表达蛋白的免疫原性。结果 扩增出长约1700 bp的ureB基因,测序结果表明扩增出的ureB基因与基因库Hp ureB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实ureB基因克隆入真核表达载体pIRES,并成功构建了Hp ureB基因的减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,重组核酸疫苗稳定,并且Western印迹法检测到特异性的蛋白条带。结论 构建了具有免疫反应性的Hp UreB减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,为进一步探索其体内的免疫作用奠定了基础。(本文来源于《上海医学》期刊2005年04期）
徐飏,严杰,叶嗣颖,毛亚飞,李立伟[5]（2004）在《重组尿素酶B亚单位和黏附素双价疫苗对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠的免疫保护作用》一文中研究指出幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是人慢性胃炎和胃溃疡的病原菌,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生有密切关系。接种疫苗是预防Hp感染和控制Hp感染相关疾病最为有效的措施,但目前仍无Hp疫苗上市。Hp尿素酶B亚单位(UreB)和黏附素(Hpa(本文来源于《中华微生物学和免疫学杂志》期刊2004年05期）
李国庆,陈旻湖,朱森林,陈洁,焦志勇[6]（2003）在《重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位和过氧化氢酶疫苗治疗幽门螺杆菌感染的实验研究》一文中研究指出目的 利用人类幽门螺杆菌 (Hp)感染的小鼠模型研究重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位和过氧化氢酶疫苗在治疗Hp感染中的作用。 方法 将 30只二级C5 7BL/ 6小鼠随机分成 3组 ,通过灌胃方法每只小鼠均用活力良好的Hp菌株隔日攻击 2次。在第二次Hp攻击后 4周 ,分别给予重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位疫苗 (A组 )、过氧化氢酶疫苗 (B组 )和生理盐水 (C组 )灌胃 1次 ,4周后处死动物 ,取胃组织分别行尿素酶试验、改良Giemsa染色及定量细菌培养 ,观察Hp定植情况。行HE染色观察胃黏膜组织炎症情况。取脾组织行淋巴细胞增殖试验。结果 C组小鼠Hp定植密度为 1.92× 10 6CFU/g胃组织 ,A组和B组小鼠分别为 1.5 8× 10 5CFU/g和 4 .88× 10 5CFU/g胃组织 ,两个治疗组的定植密度明显降低 (P <0 .0 5 )。治疗组与对照组胃黏膜均无明显炎症反应。治疗组脾淋巴细胞增殖试验阳性。结论 重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位疫苗和过氧化氢酶疫苗对Hp感染有治疗作用。(本文来源于《中华消化杂志》期刊2003年07期）
鲁东水,毛旭虎,邹全明,吴超,杨珺[7]（2003）在《重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质》一文中研究指出目的基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因,并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。结果重组UreB在大肠杆菌中表达,相对分子质量约62 000,表达率26%,N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP,肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB/c小鼠,能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示,重组UreB具有良好的免疫原性和反应性,表现出与天然Hp UreB相似的生物学功能。结论为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。(本文来源于《第一军医大学学报》期刊2003年06期）
鲁东水,毛旭虎,邹全明,吴超,张卫军[8]（2003）在《重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质研究》一文中研究指出目的 分析重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质。方法 重组尿素酶B亚单位注射免疫BALB/c小鼠、家兔 ,双向琼脂扩散、ELISA、免疫印迹分析特异抗体的产生及性质。结果 重组尿素酶B亚单位能有效刺激机体的免疫应答 ,且产生的抗体能与天然幽门螺杆菌发生抗原抗体反应。结论 重组尿素酶B亚单位表现出天然幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质 ,提示可作为幽门螺杆菌特异性抗体检测的包被抗原及幽门螺杆菌疫苗的有效成分(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2003年10期）
高志刚,邹全明,郭刚,郭桐生,曾韦锟[9]（2003）在《重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗鼻腔免疫的实验研究》一文中研究指出目的:探讨基因工程疫苗Hp重组尿素酶B亚单位(rUreB)鼻腔接种的免疫效果。方法:以rUreB不同剂量或加不同佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠。末次免疫7 d后,收集血清及胃黏膜、小肠黏膜、鼻黏膜及气管黏膜冲洗液,用ELISA法检测抗rUreB特异性抗体。结果:rUreB鼻腔免疫后各实验组血清特异性IgG及各黏膜冲洗液中特异性IgA的水平均明显增高,与对照组相比较差异显着(P<0.01)。20μg剂量组与10μg剂量组相比较,仅血清特异性IgG水平增高,其它黏膜特异性IgA的水平未见增高。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂效果较霍乱毒素B亚单位(CTB)强,卡泊波可增强鼻腔接种疫苗在胃黏膜洗液中的抗体应答水平。结论:CTB、LTB、卡泊波均可作为rUreB鼻腔黏膜接种的佐剂。HprUreB鼻黏膜接种,不仅可诱导血清特异性抗体反应,而且能引起多个黏膜部位的免疫应答,是一种方便、有效、廉价的免疫途径。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2003年01期）
陈喆,严杰,毛亚飞,钊守凤[10]（2003）在《幽门螺杆菌临床菌株尿素酶B亚单位原核表达系统的构建及其重组蛋白免疫性的鉴定》一文中研究指出目的 :克隆幽门螺杆菌 (Hp) ure B基因并构建其原核表达系统。方法 :采用高保真 PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株 Y0 6中扩增 ure B基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 p ET32 a的 ure B表达载体 ,在 E.coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达 ,采用 Hp全菌抗体的 Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果 :所克隆的 ure B基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 96.88%～ 97.82 % ,氨基酸序列同源性高达 99.65 %～ 99.82 %。p ET32 a- ure B- BL2 1DE3系统的 Ure B融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的4 0 %左右。Ure B融合蛋白能与 Hp全菌抗体发生结合反应 ,免疫家兔能获得高效价抗体。结论 :本研究成功地构建了 Hp ure B高效表达系统 ,所表达的 Ure B融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性 ,可作为 Hp疫苗的抗原。(本文来源于《浙江大学学报(医学版)》期刊2003年01期）
重组尿素酶亚单位论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)为一种革兰阴性细菌,是人类慢性活动性胃炎和消化溃疡的重要原因,被确认是胃癌和胃淋巴样组织淋巴瘤的危险因子。Hp感染与社会经济状况密切相关,在许多发展中国家其感染率超过50%,在发达国家达40%。Hp感染后若不采取特殊治疗措施常常为终身带菌。由于胃内的高酸性对抗生素有较大影响,所以,这些抗生素往往要与质子泵抑制剂和雷尼替丁枸橼酸铋同时使用。虽然组合抗生素方法对于治疗Hp感染是有效的,但是研制一种有效的疫苗将会更有益处,特别是在胃癌发病率高、感染复发率大和抗生素耐药性不断增高的国家。实验证明疫苗疗法对于Hp感染动物模型是相当成功的,然而在此基础上研制一种人类预防或治疗性疫苗仍然是非常困难的。采用众多候选疫苗进行的大量临床试验表明其效力较差。人类在通过口服抗体治疗和预防Hp方面也进行了许多尝试,实验证明口服抗尿素酶IgA单克隆抗体可保护小鼠不受猫胃螺杆菌(Helicobacter felis)感染。另有实验证实sIgA在儿童期防止消化道Hp感染中起着重要的作用,母乳中的IgA被摄入后能在消化道粘膜表面清除外来微生物或随食物吞咽下的抗原。Tharas在冈比亚的研究发现,生后第一年未感染幽门螺杆菌的婴儿的母乳其特异性sIgA滴度较感染婴儿的母乳中高2～4倍,表明了母乳通过抗体依赖机制在防止幽门螺杆菌感染上起重要作用,尤其是Hp感染的母亲其高浓度的特异性sIgA能大大延迟婴儿的幽门螺杆菌感染,而第二年以后的感染可能与母婴的密切接触以及断乳有关。以上实验说明特异性抗Hp sIgA在预防和治疗Hp感染方面具有重要作用。然而,单克隆抗体为鼠源且不能大规模生产,而从母乳中提取足量的sIgA分子也不现实。所以,有必要通过抗体工程技术获得大量特异性针对Hp的sIgA分子。1994年,Michette et al.首次利用纯化的Hp尿素酶作为抗原免疫小鼠,显示对猫螺杆菌(Hf)感染有良好的保护作用,分别口服Hp尿素酶(全部结构)或其A亚单位、B亚单位,再加上霍乱毒素(CT)作为佐剂,结果证明了起保护作用的是B亚单位(UreB)。另有许多实验证明,Hp UreB能够作为口服疫苗用于预防和治疗Hp感染。所以,我们决定构建抗Hp UreB sIgA分子。主要研究结果如下:1.抗Hp噬菌体单链抗体库的构建和筛选首先检测献血员抗Hp和rUreB抗体,分离阳性者外周血淋巴细胞,提取总RNA并等量混合。利用RT-PCR扩增全套重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,分子量分别约为400bp和350bp。将VH和VL纯化后采用overlap方法连接,插入噬菌体载体pComb3x构建成库容量为4.6 x 10~8的单链抗体噬菌体库。以纯化rUreB为靶标包被96孔板,用3%BSA封闭液封闭,加入噬菌体孵育后,用洗脱液冲洗5次进行筛选。之后的筛选逐渐降低rUreB包被浓度,并增加冲洗次数。在5轮筛选之后,获得与rUreB发生反应的41个克隆,最强的克隆命名为scFv1,通过免疫印迹的方法证明,scFv1仅与rUreB和Hp菌株反应,不与非Hp菌株反应,因此,将scFv1送出测序。2.表达载体pcDNA3.1(+):HSVHCα1和pcDNA3.1(+):LSVLCλ2的构建首先分离人外周血中性粒细胞并提取RNA,采用RT-PCR的方法获得人IgA1重链恒定区(Cα1)基因,该片段分别含有EcoRI和XbaI酶切位点。重链信号肽编码序列是通过引物之间重迭延伸的方法获得的。该序列与VH片段的连接采用overlap的方法,连接物含有HindIII和EcoRI酶切位点。表达载体pcDNA3.1(+):HSVHCα1是通过叁个部分连接而成:(i)经HindIII /XbaI酶切的质粒pcDNA3.1(+), (ii)经HindIII/ EcoRI处理的重链信号肽编码序列与VH片段的连接物,(iii)经EcoRI/ XbaI消化的Cα1基因。轻链恒定区(Cλ2)编码序列是从人脾细胞基因组DNA通过PCR获得的,该片段含有EcoRI和NotI酶切位点。轻链信号肽编码序列的获得采用与重链信号肽相同的方法。该序列与VL片段的连接同样采用overlap的方法,连接物引入HindIII和EcoRI两个酶切位点。表达载体pcDNA3.1(+):LSVLCλ_2同样由叁部分装配而成:(i)经HindIII /NotI酶切的质粒pcDNA3.1(+), (ii)经HindIII/ EcoRI处理的轻链信号肽编码序列与VL片段的连接物,(iii)经EcoRI /NotI消化的Cλ2基因。3.表达载体pcDNA3.1(+)Hyg:J Chain和pcDNA3.1(-)Bsd:SC的构建首先用SmaI和Bpu14I处理质粒pcDNA3.1 (+)以切除neoR抗性基因。hygR抗性基因是以质粒pMEP4 (Invitrogen)为模板通过PCR的方法获得的,分子量大约为1.1 kb,并且含有SmaI和Bpu14I酶切位点。用SmaI和Bpu14I酶切PCR产物后,与切除neoR抗性基因的pcDNA3.1(+)连接产生质粒pcDNA3.1(+)Hyg。人J链编码序列是以人脾细胞RNA为模板通过RT-PCR获得的,分子量大约为430bp,含有HindIII和NotI酶切位点。用HindIII和NotI处理RT-PCR产物和pcDNA3.1(+)Hyg后,将二者相连形成表达载体pcDNA3.1(+)Hyg:Jchain。分泌片(Secretory component,SC)的编码序列是采用RT-PCR方法从人结肠腺癌HT29细胞中获得的,含有HindIII和XbaI两个酶切位点。用HindIII和XbaI处理RT-PCR产物和质粒pcDNA3.1(-)Bsd,然后将二者相连形成表达载体pcDNA3.1(-)Bsd:SC。4.稳定表达特异性针对Hp UreB sIgA的CHO细胞的筛选首先用含有小牛血清、Hepes(pH 7.0)、青霉素和链霉素的IMDM培养CHO细胞。对1×107CHO细胞进行电穿孔,用ScaI-线性化的pcDNA3.1(+):HSVHCα1和BglII-线性化的pcDNA3.1(+):LSVLCλ2转染CHO细胞。24 h后用500μg/ml G418开始筛选,连续进行3周。挑取单克隆于96孔板,dot-ELISA法检测细胞培养上清。对表达最大量IgA1的克隆(Clone1)进行扩大培养,用BglII–线性化的pcDNA3.1(+)Hyg:Jchain进行电转染。在500μg/ml G418和400μg/ml潮霉素同时存在的条件下筛选,从而获得了表达最大量dIgA的克隆(Clone 2)。对1×107CHO细胞进行电穿孔,然后用BglII-线性化的pcDNA3.1(-)Bsd:SC进行转染。24 h后用10μg/ml杀稻瘟菌素开始筛选,连续进行3周。挑取单克隆于96孔板,dot-ELISA法检测细胞培养上清,获得表达最大量dIgA的克隆(Clone 3)。将Clone 2和Clone 3细胞培养上清浓缩,37℃作用2h。这样,通过dIgA和SC结合我们得到sIgA分子。sIgA的特异性通过免疫印迹的方法证明,sIgA仅与rUreB和Hp菌株反应,不与非Hp菌株反应。另外,Hp菌株与sIgA作用后,其粘附胃上皮细胞GES-1的能力大大减弱,证明sIgA具有阻断Hp粘附胃上皮细胞的作用。总之,我们通过实验证明了可在异种哺乳细胞中生产人sIgA全分子,而且特异性针对Hp UreB sIgA可以阻断Hp粘附胃上皮细胞GES-1。我们的数据说明sIgA可能会成为抗生素治疗无效患者的替代或者补充治疗方法。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
重组尿素酶亚单位论文参考文献
[1].高志刚,邹全明,刘凤英,曹向光.重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位鼻腔免疫凝胶剂的研制[J].中国现代应用药学.2007
[2].王缚鲲.重组人抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位sIgA分子的构建表达及特性研究[D].第叁军医大学.2007
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