拟南芥双特异性蛋白磷酸酶AtDsPTP1的调控机制研究

论文摘要

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)信号通路普遍存在于所有真核生物中,当受到细胞外界刺激,如炎症,细胞因子诱导,环境胁迫等,该信号通路上的多个激酶可以级联激活,参与到植物生长、免疫调控等多个重要过程中。MKPs(MAPK phosphatases)是一类特异性去磷酸化MAPK的蛋白磷酸酶,能够精确调控MAPK信号的强度及其持续性。目前在拟南芥中鉴定到二十多种MAPKs,但MKPs只发现了五种,它们之间的对应关系、识别及调控机制到目前为止都不清楚。本论文主要是从拟南芥cDNA文库中克隆出双特异性蛋白磷酸酶DsPTP1(dual specificity protein phosphatase1)及其主要调控蛋白 CaMs(Camodulins),运用蛋白纯化相关实验技术手段,获得了高浓度、高纯度的重组蛋白。用酶动力学的方法测定了DsPTP1对小分子底物pNPP的催化能力,证明DsPTP1是一个具备活力的蛋白磷酸酶,并检测了 CaM2存在时DsPTP1的活力,发现CaM2的结合能增强DsPTP1对pNPP的亲和力,从而提高其对pNPP的活力。用蛋白质印迹方法验证了 DsPTP1能去磷酸化其生理底物,磷酸化的MPK4,而CaM2的结合会抑制其催化能力。为了解释这一现象,我们尝试用结构生物学方法阐明DsPTP1与MPK4识别的分子机制,以及不同CaM对DsPTP1活力调控的机制,但是目前只获得DsPTP1的微晶,还未筛选出DsPTP1与CaM2复合物的晶体。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 引言
•   1.1 蛋白激酶简介
•   1.2 MAPKs信号通路概述
•   1.3 蛋白磷酸酶简介
•   1.4 MAPKs的磷酸酶MKPs的简介
•   1.5 植物拟南芥中MKPs的简介
•   1.6 关于DsPTP1的研究进展及意义
• 第2章 重组克隆的构建及蛋白纯化
•   2.1 实验材料和仪器
•     2.1.1 材料
•     2.1.2 仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 分子克隆实验方法
•     2.2.2 蛋白表达与纯化的方法
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 引物设计
•     2.3.2 PCR扩增目的片段
•     2.3.3 酶切目的片段
•     2.3.4 PCR screen
•     2.3.5 试表达
•     2.3.6 试提蛋白
•     2.3.7 提蛋白DsPTP1和CaM
•   2.4 本章总结
• 第3章 DsPTP1去磷酸化能力的检测
•   3.1 实验材料和仪器
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 酶动力学方法
•     3.2.2 蛋白质印迹方法
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 DsPTP1对pNPP去磷酸化能力的检测
•     3.3.2 Western blot检测DsPTP1对MPK4的去磷酸化能力
• 第4章 CaM对DsPTPl的调控
•   4.1 相互作用分析方法
•   4.2 实验结果
•     4.2.1 相互作用结果图
•     4.2.2 CaM2影响DsPTP1对pNPP的去磷酸化能力
•     4.2.3 CaM2影响DsPTP1对MPK4的去磷酸化能力
•   4.3 本章讨论
• 第5章 DsPTP1单独及与CaM2复合物的结晶
•   5.1 实验方法
•     5.1.2 复合物制备方法
•     5.1.3 蛋白质结晶的方法
•   5.2 实验结果
•     5.2.1 复合物的制备
•     5.2.2 结晶
• 第6章 论文总结
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐荣

导师: 吴嘉炜

关键词: 调控机制

来源: 苏州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 苏州大学

分类号: Q945

DOI: 10.27351/d.cnki.gszhu.2019.002488

总页数: 60

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