昆明白小鼠胚胎生殖细胞的分离与培养

论文摘要

胚胎生殖细胞（embryonic germ cells,EG）是来源于原始生殖细胞（primordial germ cells,PGC）的多潜能干细胞。本研究旨在优化昆明白小鼠EG细胞的培养条件。以昆明白小鼠10.5dpc胚胎PGC为材料,以丝裂霉素C处理的小鼠成纤维细胞（mouse embryonic germ cells,MEF）为饲养层,培养小鼠EG细胞,以对影响小鼠EG细胞传代的因素进行探讨。用ELISA试剂盒定量检测MEF自身分泌生长因子SCF、bFGF、LIF的浓度;以培养液是否添加生长因子,观察PGC/EG的培养效果;比较了机械分割法、胰酶消化法和胶原酶Ⅳ消化法对EG传代培养的影响;对获得的EG进行多能性鉴定。结果表明,培养3d的饲养层上清液中含75.7ng/L SCF、125.7ng/L bFGF、196.6ng/L LIF,培养5d的饲养层上清液中含76.2ng/L SCF、136.2ng/L bFGF、214.2ng/L LIF;培养液添加生长因子显著提高了EG的克隆数、传代数（P<0.05）;机械分割法与酶消化法对EG传代差异显著（P<0.05）,而两种酶法对EG传代无显著影响（P>0.05）;所分离的EG细胞显示AKP染色强阳性;EG体外培养时会自分化为神经样细胞、上皮样细胞;EG细胞呈Oct4、SSEA-1的免疫荧光检测阳性。结果提示,饲养层自身能分泌少量生长因子,但培养液中添加生长因子可显著改善昆明白小鼠EG培养效果,酶消化法更适合于昆明白小鼠EG的传代培养。

论文目录

• 1 材料和方法
•   1.1 实验动物的处理
•   1.2 饲养层细胞实验
•     1.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞MEF的分离培养与传代
•     1.2.2 饲养层的制备
•     1.2.3 饲养层细胞分泌的生长因子浓度的测定
•   1.3 昆明白小鼠胚胎生殖细胞的分离、培养与鉴定
•     1.3.1 胚胎生殖细胞的分离与培养
•     1.3.2 胚胎生殖细胞的传代培养
•   1.4 昆明白小鼠EG的鉴定
•     1.4.1 形态学鉴定
•     1.4.2 碱性磷酸酶活性检测
•     1.4.3 Oct4基因表达产物 （OCT4） 的免疫荧光检测
•     1.4.4 阶段特异性胚胎抗原SSEA-1的免疫荧光检测
•     1.4.5 胚胎生殖细胞的自发分化
•   1.5 统计分析
• 2 结果与分析
•   2.1 饲养层细胞分泌生长因子浓度的测定
•   2.2 生长因子对EG培养的影响
•   2.3 不同传代方式对EG培养的影响
•   2.4 小鼠EG的形态学鉴定
•   2.5 AKP染色
•   2.6 Oct4基因表达产物 （OCT4） 的免疫荧光检测
•   2.7 阶段特异性胚胎抗原SSEA-1的免疫荧光检测
•   2.8 EG的自发分化
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 赵向远,李洋,刘延玲,董焕声,王红军,董晓

关键词: 胚胎生殖细胞,饲养层,生长因子,传代方法,分化

来源: 青岛农业大学学报(自然科学版) 2019年02期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 青岛农业大学动物科技学院,青岛农业大学生命科学学院,临朐县东城街道卫生院

基金: 青岛农业大学高层次人才科研基金(6631117017),山东省自然科学基金2017年面上项目(ZR201702210030)

分类号: Q813

页码: 85-90+102

总页数: 7

文件大小: 389K

下载量: 147