烟草中NtPLR基因的鉴定、RNAi和亚细胞定位

论文摘要

维生素B6（Vitamin B6,VB6）是一类可以相互转换的吡啶类化合物的总称。其中,PLP（磷酸吡哆醛）主要发挥辅酶作用,参与近140多种酶的代谢和调节过程。植物作为人类VB6营养的主要来源,研究植物体内VB6的合成和代谢转换具有重要意义。植物体内除利用“DXP非依赖途径”（DXP independent pathway）来直接从头合成（de novo synthetic）PLP 外,还存在 PLP 的补救合成途径（salvage pathway）,该途径通过一系列酶的作用,实现不同VB6的相互转化和PLP的补救合成,以及维持VB6状态的稳定。PLP的补救合成主要涉及三种普遍存在的酶:ATP依赖性PL激酶（PL kinase,PLK）、FMN 依赖性 PNP 氧化酶（PNP oxidase,PNPO）和 NADPH依赖性PL还原酶（Pyridoxal Reductase,PLR）。PL在PL还原酶的作用下产生PN,而PN是大多数植物源食品中维生素B6含量的主要成分。因此,PL还原酶的研究对于阐明植物中PN的来源非常重要。此外,PL激酶和PNP氧化酶已在植物中进行了详细研究,而关于植物体内PL还原酶的研究较少。因此开展本研究对全面理解、以及探索植物体内VB6补救合成途径的代谢转换的机理奠定了基础。本研究利用已知的拟南芥PLR序列通过BLAST 比对得到预测的烟草中的PLR序列。该序列由1110 bp碱基组成,编码369个氨基酸,编码蛋白质的分子量是41.1KD,等电点是9.59,属于醛-酮还原酶超家族。通过PCR克隆技术扩增烟草中的NtPLR基因序列,并通过构建原核表达载体将克隆的NtPLR基因序列导入表达载体PET28a中,并成功诱导和纯化出表达蛋白。利用分光光度计对NtPLR进行体外酶活测定,确定PL在PL还原酶的作用下反应生成PN。在本实验中,利用RNAi技术构建出烟草中含NtPLR基因的RNAi载体,利用荧光定量PCR检测发现NtPLR基因在侵染72h后的下调效果最好,且NtPLR基因下调后间接地引起了其他VB6代谢酶基因转录水平的普遍下调。本实验利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达法,构建NtPLR-GFP定位载体,在激光共聚焦荧光显微镜下显示NtPLR定位于细胞叶绿体中。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 本文常见缩写
• 1 文献综述
•   1.1 维生素B6的简介及主要的生理功能
•   1.2 生物体内VB6的从头合成
•   1.3 生物体内VB6从头合成后的代谢转换
•   1.4 PLR的研究进展
•     1.4.1 微生物中PLR的研究概述
•     1.4.2 植物中PLR的研究概述
•   1.5 RNAi简介
•   1.6 植物蛋白质亚细胞定位的简介
• 2 引言
•   2.1 课题研究的目的与意义
•   2.2 研究内容
•   2.3 技术路线
• 3 材料与方法
•   3.1 材料、实验设备及主要试剂
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 实验设备
•     3.1.3 主要试剂
•     3.1.4 常用试剂配制
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 烟草NtPLR基因的生物信息学分析
•     3.2.2 烟草NtPLR基因克隆
•     3.2.3 构建原核表达载体的构建
•     3.2.4 重组蛋白的诱导表达与纯化
•     3.2.5 NtPLR酶活的测定
•     3.2.6 NtPLR RNAi载体的构建
•     3.2.7 农杆菌侵染烟草叶片
•     3.2.8 荧光定量检测
•     3.2.9 烟草NtPLR基因的亚细胞定位
• 4 结果与分析
•   4.1 烟草NtPLR基因的序列分析
•   4.2 烟草NtPLR基因的克隆
•     4.2.1 烟草总RNA的提取和cDNA的合成
•     4.2.2 烟草NtPLR基因的扩增
•   4.3 烟草NtPLR的原核表达
•   4.4 烟草NtPLR的功能鉴定
•   4.5 RNAi载体的构建
•     4.5.1 NtPLR在RNAi载体中的图谱
•     4.5.2 NtPLR基因RNAi载体的构建
•     4.5.3 烟草NtPLR的RNAi瞬时沉默效率检测
• 6代谢其他相关基因的变化'>    4.5.4 烟草NtPLR瞬时沉默后VB₆代谢其他相关基因的变化
•   4.6 NtPLR的亚细胞定位
•     4.6.1 NtPLR的亚细胞定位的软件预测
•     4.6.2 亚细胞定位载体的构建和农杆菌的转化
•     4.6.3 烟草侵染及荧光观察
• 5 讨论
•   5.1 NtPLR的氨基酸序列分析
•   5.2 NtPLR基因的功能鉴定
• 6代谢其他相关基因的影响'>  5.3 NtPLR RNAi对VB₆代谢其他相关基因的影响
•   5.4 NtPLR基因的亚细胞定位
• 6 结论
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈星星

导师: 黄龙全

关键词: 植物烟草,还原酶,原核表达,技术,亚细胞定位

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 安徽农业大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000215

总页数: 62

文件大小: 3991K

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