大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因halI/R的克隆、表达及功能初析

论文摘要

蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei）是一种杆状革兰氏阴性细菌,为肠杆菌科哈夫尼亚菌属的代表性细菌。因其具有嗜冷、喜好厌氧潮湿环境等特点,常常成为低温贮藏食品中的特定腐败菌（Specific Spoilage Organisms,SSO）。研究表明,其致腐行为受由N-酰基-高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）介导的lux型群体感应系统的调控。因此,本文以腐败大菱鲆中分离纯化得到的一株蜂房哈夫尼亚菌Ha-01为研究对象,通过基因工程和生物信息学等技术研究其菌株内的lux型群体感应调控基因halI/R,初步探究二者编码的HalI/R蛋白的功能性质,并讨论二者能否对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的形成起到调控作用。研究旨在探讨由群体感应系统调节的鱼类腐败机制,为建立以靶向控制群体感应系统为基础的水产品保鲜新技术提供理论依据。1.根据GenBank中登录halI/R基因序列设计特异性扩增全长引物,利用TA克隆技术构建克隆载体pMD-halI和pMD-halR,并导入宿主E.coli JM109中大量扩增;后经测序及BLAST比对分析,结果显示由蜂房哈夫尼亚菌Ha-01中克隆、测序获取的基因片段序列与已登录的halI/R基因序列相似度分别达100%和99%,这表明大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌Ha-01中确实存在群体感应基因halI及halR。2.从halI/R基因编码的氨基酸序列出发,预测了HalI/R蛋白的基本性质,其中HalI大小为25.06 KDa、理论等电点为5.46,HalR大小为27.97KDa、理论等电点为6.98;疏水性分析表明二者均为亲水性蛋白;不含有信号肽和跨膜区表明二者均为非分泌蛋白,可能在胞内有可溶性表达;功能区预测显示二者分别具有自诱导物合成酶特征结构、LuxR型蛋白的HTH特征结构;二级结构和立体结构预测结果表明它们具有明显的构象差异,且预测的三维模型质量良好可用于后续分子对接研究;蛋白交互作用结果表明二者可构成一套群体感应系统,并对细菌生物膜的产生具有调控作用。另一方面,从halI/R基因的核酸序列出发对它们的密码子使用偏向性进行了分析,结果表明二者宜用大肠杆菌表达系统进行表达。3.将目的基因进行密码子优化以提高理论表达效率;利用In-fusion克隆技术成功构建出重组表达质粒pET22-halI和pET28-halR,转化至宿主菌E.coli BL21（DE3）进行诱导表达,诱导条件为37℃,1mM IPTG诱导4 h;SDS-PAGE和Western Blotting结果表明,二者均能在大肠杆菌宿主BL21（DE3）内实现高效表达,且部分为胞内可溶性表达。4.生物感应器菌株CV026产色实验和GC-MS分析结果表明HalI蛋白能够合成AHLs类信号分子C6-HSL,其在蜂房哈夫尼亚菌QS系统中起自诱导物合成酶的功能;体外结合实验和分子对接结果表明HalR蛋白主要以氢键作用结合C6-HSL,其在蜂房哈夫尼亚菌QS系统中起受体蛋白的功能;此外,生物膜的相关结果表明,二者构成的HalI/R群体感应系统对蜂房哈夫尼亚菌Ha-01生物膜的形成具有明显的调控作用。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 群体感应现象
•     1.1.1 群体感应的发现
•     1.1.2 群体感应的类型
•   1.2 群体感应相关蛋白及其分子机制
•     1.2.1 LuxI-type信号分子合成酶
•     1.2.2 LuxR-type转录因子
•     1.2.3 LuxR-type转录因子与AHL分子及靶基因的相互作用
•   1.3 群体感应与水产品腐败
•     1.3.1 水产品特定腐败菌
•     1.3.2 水产腐败菌的QS系统
•     1.3.3 水产品致腐因子与群体感应
•   1.4 研究的主要内容、目的及意义
• 第二章 大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因的克隆
•   2.1 前言
•   2.2 材料与仪器
•     2.2.1 实验菌株及培养条件
•     2.2.2 质粒与引物
•     2.2.3 主要试剂
•     2.2.4 主要仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 菌种活化
•     2.3.2 蜂房哈夫尼亚菌Ha-01基因组DNA提取
•     2.3.3 引物设计及合成
•     2.3.4 蜂房哈夫尼亚菌Ha-01目的基因halI/R的 PCR扩增
•     2.3.5 琼脂糖凝胶电泳
•     2.3.6 克隆载体的构建
•     2.3.7 阳性克隆子的筛选、鉴定与质粒抽提
•     2.3.8 克隆载体测序及序列比对
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 蜂房哈夫尼亚菌Ha-01目的基因halI/R的PCR扩增与产物纯化
•     2.4.2 阳性转化子E.coli JM109（pMD-halI,pMD-halR）的筛选
•     2.4.3 阳性转化子E.coli JM109（pMD-halI,pMD-halR）的鉴定
•     2.4.4 阳性克隆质粒pMD-halI,pMD-halR的测序结果
•     2.4.5 目的片段的序列比对结果
•   2.5 小结
• 第三章 蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因halI/R的生物信息学分析
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料与分析工具
•     3.2.1 halI和halR的核酸序列
•     3.2.2 生物信息学分析工具
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 HalI/R蛋白一级结构的确定
•     3.3.2 HalI/R蛋白的序列比对分析
•     3.3.3 HalI/R蛋白理化性质的预测
•     3.3.4 HalI/R蛋白的功能性预测
•     3.3.5 HalI/R蛋白的二级结构预测
•     3.3.6 HalI/R蛋白的三维构象预测
•     3.3.7 蛋白间的相互作用研究
•     3.3.8 蛋白表达系统的选择
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 HalI/R蛋白一级结构的确定
•     3.4.2 HalI/R蛋白的BLAST分析
•     3.4.3 HalI/R蛋白理化性质的预测
•     3.4.4 HalI/R蛋白功能预测
•     3.4.5 HalI/R蛋白的二级结构预测
•     3.4.6 HalI/R蛋白的三维构象模型
•     3.4.7 蛋白质交互作用研究
•     3.4.8 halI/R基因密码子偏向性分析
•   3.5 小结
• 第四章 蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因halI/R的密码子优化与表达模型构建
•   4.1 前言
•   4.2 材料与仪器
•     4.2.1 实验菌株与质粒
•     4.2.2 引物
•     4.2.3 主要试剂
•     4.2.4 主要仪器
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 halI/R基因密码子的优化与分析
•     4.3.2 表达载体的构建
•     4.3.3 阳性质粒转化表达宿主菌E.coli BL21（DE3）
•     4.3.4 阳性菌落pET22-halI-BL21、pET28-halR-BL21 的筛选
•     4.3.5 重组蛋白的诱导表达
•     4.3.6 重组蛋白表达情况的分析
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 halI/R基因密码子的优化与分析
•     4.4.2 插入片段的获取
•     4.4.3 表达质粒的线性化
•     4.4.4 阳性克隆子的筛选与鉴定
•     4.4.5 阳性转化子E.coli BL21（DE3）的筛选
•     4.4.6 目的蛋白的诱导表达
•     4.4.7 表达情况分析及Western Blotting鉴定
•   4.5 小结
• 第五章 蜂房哈夫尼亚菌HalI/R功能的初步研究
•   5.1 前言
•   5.2 材料与仪器
•     5.2.1 实验菌株及培养条件
•     5.2.2 材料准备
•     5.2.3 主要试剂
•     5.2.4 主要仪器
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 生物感应器菌株检测HalI蛋白合成AHL信号分子的能力
•     5.3.2 GC-MS分析HalI蛋白所产信号分子的种类
•     5.3.3 GC-MS分析HalR蛋白结合信号分子的能力
•     5.3.4 分子对接分析HalR蛋白结合信号分子的作用机理
•     5.3.5 HalI蛋白合成产物对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的影响
•   5.4 结果与讨论
•     5.4.1 HalI蛋白合成AHL信号分子的能力
•     5.4.2 HalI蛋白合成信号分子的种类
•     5.4.3 HalR蛋白结合信号分子的能力分析
•     5.4.4 HalI蛋白合成产物对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的影响
•   5.5 小结
• 第六章 总结、创新点及展望
•   6.1 总结
•   6.2 创新点
•   6.3 展望
• 参考文献
• 硕士期间发表论文情况
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 梅永超

导师: 励建荣,李婷婷

关键词: 大菱鲆,蜂房哈夫尼亚菌,群体感应,基因克隆,功能分析

来源: 渤海大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,轻工业手工业

单位: 渤海大学

基金: 国家自然科学基金面上项目“基于群体感应途径的荧光假单胞菌对大菱鲆的致腐机制”(No.31471639),国家重点研发计划 “预制调理食品制造关键技术与新产品研究及新型速冻技术装备开发” 项目(No.2018YFD0400601)

分类号: TS201.3;Q78

总页数: 91

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