CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究

论文摘要

CRISPR系统已经成为生物研究中不可或缺的工具之一。至今为止,CRISPR-Cas9不再仅仅是一种基因编辑工具,它的应用领域范围扩展到基因调控、表观遗传编辑、染色质工程和成像等方面,已远远超过了野生型（WT）Cas9本身的基因编辑功能。CRISPR相关新技术的开发和应用将是未来研究的热点问题。本研究主要是应用CRISPR/Cas9系统相关新技术在小鼠细胞、胚胎及人的胚胎中对靶基因进行基因编辑,从而探讨这些新技术是否能安全、有效的应用于遗传疾病治疗。首先,本研究通过在小鼠细胞中比较CasRx系统抑制NHEJ途径重要因子Lig4并结合CRISPR/Cas9系统及Cas9-ORF52蛋白（Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52蛋白）共表达这两种策略对同源重组效率的影响,证明这两种方法均能显著的提高同源重组的效率,为在临床疾病治疗中实现需要定向碱基插入或靶向点突变的精确基因组编辑应用提供了新的策略。其次,应用BE3碱基编辑系统,即Crispr-stop新技术对小鼠体内3个基因单独或同时进行敲除,旨在可以在F0代中产生直接用于分析的单个或三个纯合突变小鼠,避免繁琐的小鼠繁殖过程并能使研究小鼠基因功能成为一种模式化操作。最后,将单碱基编辑系统,即BE3、ABE7.10分别与传统CRISPR相关技术进行基因编辑效率的比较,结果显示BE3和ABE7.10系统比传统CRISPR相关技术均更具优势。同时还应用BE3系统在人类胚胎中进行碱基编辑,证实BE3系统可在人类三核（3PN）受精卵中进行有效且精确的碱基编辑。主要研究结果如下:1.检测CasRx系统和共表达Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52蛋白在小鼠细胞中提高同源重组效率的相关研究为了提高HDR（homology-directedrepair,HDR）效率,以便能够插入精确的遗传修饰,本实验在小鼠N2A细胞的荧光报告系统中分析比较了两种策略:使用CasRx系统抑制NHEJ（Non-homologous end joining,NHEJ）途径中的关键分子DNA连接酶IV,以及Kaposi肉瘤相关的疱疹病毒（KSHV）ORF52蛋白与Cas9蛋白共表达这两种策略。结果发现CasRx系统对DNA连接酶IV的抑制策略使HDR效率提高了1.4倍。当与Cas9系统共表达时,ORF52将HDR效率提高了2.1倍,因此后者略更具优势。此外,使用Cas9-ORF52共表达的策略在小鼠N2A和E14细胞对ACTB和Tubb3基因进行靶向敲入,HDR效率提高了约24倍。Cas9-ORF52共表达策略能有效增强CRISPR/Cas9介导的HDR效率,这对未来涉及精确基因组编辑的相关研究提供了新的途径。2.应用BE3碱基编辑系统对小鼠体内进行多基因同时敲除的研究利用BE3系统进行基因敲除的方法称为Crispr-stop。以小鼠听觉器官耳蜗为实验对象,本实验完成了三个不同的类型的体内实验。首先,通过破坏Atoh1（一种对听觉毛细胞生成至关重要的基因）进行了原理验证测试。其次,单独敲除了三个听觉所必需且在人类耳聋患者中具有频繁的突变率的基因:vGlut3,Otoferlin和Prestin,在F0代直接获得单基因敲除的具有听觉障碍的小鼠模型。最后,成功地同时敲除了vGlut3,Otoferlin和Prestin,F0代直接获得多基因同时敲除的小鼠。研究数据表明Crispr-stop可以在F0产生可直接用于分析单个或三个纯合突变小鼠,缩短了基因敲除的世代间隔及繁琐的小鼠繁殖过程,同时使研究小鼠基因功能成为一种模式化操作。证明体内Crispr-stop是一种非常有效的适用于研究小鼠发育过程中的功能基因的方法。3.单碱基编辑系统与传统CRISPR相关技术编辑效率比较及BE3系统对人类胚胎碱基编辑效率的研究本实验中使用的单碱基编辑系统包括BE3及ABE7.10。首先,使用ABE7.10（TadA-TadA*7.10-nCas9）诱导Tyr基因的点突变产生突变小鼠,以期证明ABE7.10在小鼠胚胎中碱基编辑的潜力。在Tyr基因上设计了三个突变位点。通过微注射ABE7.10 mRNA和sgRNA在小鼠受精卵中进行碱基编辑。三个位点突变效率分别为75%、87.5%和75%,碱基编辑率较高。将ABE7.10系统与传统的CRISPR辅助ssODN介导的同源定向修复相比较,ABE7.10系统展示了高碱基编辑效率和低Indels（插入或缺失）率,因此ABE7.10系统在靶向点突变方面更具优势。同时,针对小鼠Tyr基因设计四个基因敲除靶位点,在小鼠胚胎中将BE3系统与CRISPR-Cas9系统进行比较。实验结果表明,当使用单个sgRNA靶向敲除小鼠Tyr基因时,两种方法均会产生一定比率的嵌合小鼠出现。而当使用多个sgRNA时,嵌合率降低或为零。虽然BE3系统与CRISPR-cas9系统对基因敲除都具有很高的效率,但BE3系统产生基因敲除小鼠的嵌合率更低,纯合率更高。综上所述,单碱基突变系统在靶向点突变方面及基因敲除方面比传统CRISPR-cas9技术更具优势。使用BE3和SaKKH-BE3在人类三核（3PN）受精卵中进行基因编辑研究,结果表明BE3和SaKKH-BE3B在HBB,FANCF和DNMT3B三个基因中均具有较高的碱基编辑效率,并且在基因编辑的人胚胎中没有观察到明显的脱靶效应,证明了应用碱基编辑系统纠正未来人类胚胎中的遗传缺陷是可行的。综上所述,通过应用CRISPR系统相关新技术在小鼠细胞、胚胎及人类胚胎中去探讨基因编辑的效率、安全性及可行性,为这些技术在未来用于进行构建动物疾病模型及人类疾病治疗的研究中提供了一定的科学依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
•   1.1 基因组编辑技术的发展
•   1.2 基因组编辑相关的靶向核酸酶的发展
•   1.3 CRISPR作为基因组编辑技术的兴起
•   1.4 不同的CRISPR系统及其在基因组编辑中的应用
•   1.5 CRISPR-Cas9 系统应用的再开发
•   1.6 CRISPR-Cas9 系统功能的开发应用
•     1.6.1 第二代CRISPR基因编辑工具的发展
•     1.6.2 CRISPR介导的基因表达调控
•     1.6.3 CRISPR介导的表观基因组编辑的发展与应用
•     1.6.4 CRISPR介导的活细胞染色质成像技术的发展
•     1.6.5 大规模遗传和表观遗传学的CRISPR筛选技术发展
•   1.7 CRISPR新技术未来发展方向
•   1.8 本课题的目的、研究意义
• 第二部分 实验研究
•   第一章 利用CasRx系统和共表达Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52 蛋白在小鼠细胞中提高同源重组效率的相关研究
•     前言
•     2.1 材料与方法
•       2.1.1 实验对象
•     2.2 主要实验材料、器材及仪器
•       2.2.1 实验材料及试剂
•     2.2.1.1 细胞实验
•     2.2.1.2 分子克隆
•     2.2.1.3 主要仪器设备
•     2.3 试验方法
•       2.3.1 相关载体的构建
•       2.3.2 相关g RNA靶序列的设计和载体的构建
•       2.3.3 构建小鼠N2A细胞Rosa26EGFP+稳转细胞系
•       2.3.4 应用CasRX系统敲低瞬转的红色荧光
•       2.3.5 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因
•       2.3.6 应用CasRX系统抑制小鼠内源的Lig4 基因提高同源重组效率
•       2.3.7 通过共转ORF52 蛋白提高同源重组效率
•       2.3.8 通过共转ORF52 蛋白提高小鼠内源基因的同源重组效率
•     2.4 结果与分析
•       2.4.1 载体的构建
•       2.4.2 gRNA靶序列的设计和载体的构建
•       2.4.3 小鼠N2A细胞Rosa26EGFP+稳转细胞系产生及鉴定
•       2.4.4 应用CasRX系统敲低瞬转的红色荧光
•       2.4.5 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因
•       2.4.6 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因提高同源重组效率
•       2.4.7 通过共转Cas9与ORF52 蛋白提高同源重组效率
•       2.4.8 通过共转Cas9与ORF52 蛋白提高小鼠内源基因的同源重组效率
•     2.5 讨论
•     2.6 结论
•   第二章 应用BE3碱基编辑系统对小鼠体内进行多基因同时敲除的研究
•     前言
•     3.1 材料与方法
•       3.1.1 材料
•       3.1.2 主要仪器和试剂
•     3.1.2.1 胚胎培养实验
•     3.1.2.2 分子克隆试剂
•     3.1.2.3 主要仪器设备
•     3.1.2.4 主要使用抗体
•     3.2 实验方法
•       3.2.1 single-guide RNAs（sgRNAs）的设计
•       3.2.2 体外转录PCR模板准备
•       3.2.3 sgRNA体外转录与纯化
•       3.2.4 BE3 的体外转录与纯化
•       3.2.5 sgRNA优化,小鼠内耳/尾基因分型,靶向深度测序和TA克隆测序
•       3.2.6 样品处理,组织学和免疫荧光
•       3.2.7 全基因组测序和脱靶分析
•       3.2.8 听觉脑干诱发电位（ABR）测量
•       3.2.9 制备外毛细胞膜片钳的方法
•       3.2.10 内毛细胞膜片钳和电容测量
•     3.3 结果与分析
•       3.3.1 使用CRISPR-stop对小鼠中的Tyr基因进行碱基编辑
•       3.3.2 小鼠耳蜗中CRISPR-STOP的原理验证测试
•       3.3.3 CRISPR-STOP可有效产生不同程度耳聋的小鼠模型
•       3.3.4 Prestin和 otoferlin基因敲除小鼠也具有听力缺陷的电生理学特性
•       3.3.5 CRISPR-STOP技术可同时敲除多基因
•       3.3.6 在v Glut3,otoferlin和 prestin三敲小鼠中未观察到脱靶效应
•     3.4 讨论
•     3.5 结论
•   第三章 碱基编辑系统与传统CRISPR相关技术编辑效率的比较及BE3系统对人类3PN胚胎的碱基编辑效率的研究
•     前言
•     4.1 材料与方法
•       4.1.1 材料
•       4.1.2 主要仪器和试剂
•     4.1.2.1 胚胎培养实验
•     4.1.2.2 分子克隆试剂
•     4.1.2.3 主要仪器设备
•     4.2 实验方法
•       4.2.1 single-guide RNAs（sgRNAs）的设计
•       4.2.2 体外转录PCR模板准备
•       4.2.3 sgRNA体外转录与纯化
•       4.2.4 Cas9、ABE7.10和BE3 or SaKKH-Be3 的体外转录与纯化
•       4.2.5 人类胚胎的收集
•       4.2.6 胚胎注射
•       4.2.7 胚胎鉴定与靶位点深度测序
•       4.2.8 单个卵裂球测序分析
•       4.2.9 全基因组测序和脱靶分析
•     4.3 结果与分析
•       4.3.1 与CRISPR-Cas9 系统相比,使用ABE在小鼠胚胎中的Tyr基因中进行更有效的碱基编辑
•       4.3.2 在小鼠胚胎中BE3 系统比CRISPR-Cas9 系统进行更有效的基因敲除
•       4.3.3 人类3PN受精卵中的高效碱基编辑
•     4.4 讨论
•     4.5 结论
•   第四章 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 博士论文

作者: 潘宏

导师: 张明

关键词: 新技术,同源重组,碱基编辑,疾病治疗

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 广西大学

分类号: Q78

DOI: 10.27034/d.cnki.ggxiu.2019.000027

总页数: 143

文件大小: 4886K

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