山东省鸭坦布苏病流行病学调查和DEFs对强弱毒株的天然免疫反应比较

论文摘要

鸭坦布苏病是由坦布苏病毒（Duck Tembusu Vieus,DTMUV）引起的一种主要感染鸭的传染病,产蛋鸭感染后产蛋率会急剧下降,雏鸭感染表现为神经症状和较高的死亡率。山东省内大部分养鸭地区均存在鸭坦布苏病,严重威胁着养鸭业的健康发展。鉴于目前鸭坦布苏病尚没有可靠的预防措施,进行流行病学调查,掌握鸭坦布苏病的流行动态及病原的变异情况,有助于鸭坦布苏病的及时防控。根据对鸭的致病性,DTMUV分为强毒株（如FX2010）和弱毒株（如MM1775）,目前关于两种毒株的宿主范围、致病性等方面的比较研究多见,宿主或者细胞对两种毒株的天然免疫应答研究较少,而天然免疫可能与毒株的致病性和传播有关。对强弱毒株引起的宿主的天然免疫反应进行比较,可以为揭示DTMUV的致病机理和筛选防治药物提供理论依据。本研究对山东省不同品种、不同日龄的鸭群进行坦布病的流行调查。首先,在山东省内的泰安、菏泽、聊城等9个地区采集了未经免疫的鸭群血清4437份和临床疑似病例276份,以酶联免疫吸附试验检测血清中鸭坦布苏的抗体阳性率,以RT-PCR方法检测肝、脾、脑、肺、肾和心脏等器官中的DTMUV核酸,进一步对阳性病料进行病毒分离并测序毒力基因（E基因）序列,以Genbank上发表的流行DTMUV E基因序列为参考,构建E基因进化树并进行序列同源性比对分析。将我国流行的强毒株FX2010和蚊源的弱毒株MM1775以相同的剂量感染鸭胚成纤维细胞,在攻毒后不同时间点收集细胞样品,以相对荧光定量PCR方法检测攻毒后24和48h样品的模式识别受体（TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、RIG-Ⅰ和MDA5）炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）干扰素（IFN-α、IFN-β和IFN-γ）和干扰素刺激性应答基因（M X、OAS、PKR）等mRNA的表达量。鸭坦布苏流行病学调查结果显示:在山东省不同地区的鸭群中,均检测到不同程度的DTMUV血清抗体阳性率,其中最高的是蛋鸭群（23.9%）,其次是肉鸭群（13.9%）,最低的是后备种鸭群（12.4%）;从地区来看:DTMUV阳性率最高的是泰安地区（21.0%）,德州地区DTMUV阳性率最低（11.7%）;从鸭的品种来看,康贝尔鸭的血清阳性率（25.3%）高于金定鸭（23.6%）,绍兴鸭（22.9%）高于樱桃谷鸭（13.60%）和枫叶鸭（12.91%）;进化树结果表明:分离毒株与FX2010处于一个大分支,弱毒MM1775位于另一个分支。核苷酸同源性分析结果显示:分离株与山东2017年的流行株氨基酸同源性为98-99.2%,与2010、2011和2012年的分离株氨基酸的同源性为96.8-98.6%。分离毒株与强毒株FX2010相比未发生关键氨基酸位点的突变。DTMUV对DEFs的感染结果显示:在感染早期FX2010和MM1775都能引起DE Fs的TLR3、RIG-Ⅰ和MDA5基因mRNA表达量上调,但上调的幅度不同,MM1775引起的表达量显著或及其显著高于FX2010;在感染后期FX2010和MM1775都能引起DEFs的炎性细胞因子IL-6和TNF-α基因mRNA表达量上调,但FX2010引起的表达量显著或及其显著高于MM1775;感染早期FX2010和MM1775都能引起DEFs的干扰素刺激性基因mRNA表达量上调,但MM1775引起的MX表达量及其显著高于FX2010。2018年,山东省非免疫鸭群中仍存在鸭坦布苏病流行,不同鸭群的流行情况各不相同,不同地区的感染率高低不一,不同品种的鸭感染率差别较大;分离到的流行毒株都是强毒株,分离的流行毒株毒力基因未发生大的变异,分离株之间没有地区差异。FX2010和MM1775都能引起DEFs的PRRs及其下游基因表达上调,差异显著的有TLR3、RIG-Ⅰ、MDA5,IL-6、TNF-α、IFN-β和MX等。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1.前言
•   1.1 鸭坦布苏病概述
•   1.2 坦布苏病毒病原学
•     1.2.1 病毒分类
•     1.2.2 病毒的形态结构
•     1.2.3 病毒的基因结构
•     1.2.4 病毒的理化特性和培养
•     1.2.5 鸭坦布苏病毒概述
•   1.3 流行病学
•   1.4 临床症状和组织病理学特征
•     1.4.1 临床症状
•     1.4.2 组织病理学特征
•   1.5 诊断方法
•   1.6 先天免疫概述
•     1.6.1 Toll样受体和类视黄醇诱导基因样受体家族成员简述
•     1.6.2 炎性细胞因子成员简介
•     1.6.3 干扰素成员简述
•     1.6.4 干扰素刺激基因简述
•   1.7 DTMUV的防控措施
•   1.8 研究的目的和意义
• 2 材料方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 试验地点
•     2.1.2 主要仪器
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 试验动物、病毒、鸭胚和细胞
•     2.1.5 引物
•     2.1.6 主要溶液的配置
•     2.1.7 主要分析软件
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 流行病学调查
•       2.2.1.1 样品采集
•       2.2.1.2 背景信息统计
•       2.2.1.3 发病鸭的病理学观察
•       2.2.1.4 临床样品处理及检测
•       2.2.1.5 非免疫鸭群血清的采集和 DTMUV 抗体阳性率的检测
•     2.2.2 不同毒力的DTMUV引起DEFs的天然免疫反应的比较
•     2.2.3 统计分析
• 3 结果与分析
•   3.1 临床病例的症状表现和病理学变化
•     3.1.1 临床症状表现
•     3.1.2 剖检病变
•     3.1.3 病理组织学病变
•   3.2 病料的病原检测结果
•     3.2.1 临床疑似病例的RT-PCR检测结果
•     3.2.2 DTMUV分离结果
•     3.2.3 分离毒株E基因扩增结果
•     3.2.4 E基因序列测定与分析
•   3.3 血清检测结果与分析
•   3.4 天然疫检测结果
•     3.4.1 FX2010和MM1775在DEFs上不同时间点的致细胞病变的比较
•     3.4.2 FX2010和MM1775在DEFs上的增殖曲线
•     3.4.3 FX2010和MM1775在DEFs上不同时间点PRRs、细胞炎症因子、IFN和ISGs的mRNA表达
• 4 讨论
• 5.结论
• 6.参考文献
• 7.致谢
• 8.攻读学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李刚

导师: 蔡玉梅,刘思当

关键词: 鸭坦布苏病毒,流行病学调查,遗传进化,天然免疫,比较研究

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 国家重点研发计划项目名称:新发与再现畜禽重大疫病的致病与免疫机制研究 项目编号:(2016YFD0500100),国家重点研发计划课题名称:鸭坦布苏病毒的传播与致病的分子机制课题编号:(2016YFD0500106)

分类号: S852.65

总页数: 76

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