颠茄N-甲基腐胺氧化酶基因的克隆与功能研究

论文摘要

托品烷生物碱（tropane alkaloids,TAs）是医学上最古老的传统药物之一,已经有近3000年的使用历史。TAs主要包括莨菪碱和东莨菪碱,这两种生物碱均可以作为抗胆碱药物在临床上广泛应用于止痛、麻醉、戒毒脱瘾、抗晕动和治疗帕金森病等。药用TAs的生产完全依赖于与从茄科特定的药源植物中提取获得,这些药源植物主要有:颠茄（Atropa belladonna）、曼陀罗（Datura stramonium）和澳洲毒茄杂交种（Duboisia hybrid）等。在TAs药源植物中,托品烷生物碱含量极低,无法满足市场需求。如在颠茄中,莨菪碱仅为叶片干重0.02%-0.17%,东莨菪碱仅为叶片干重0.01%-0.08%。通过生物技术手段提高药源植物中TAs的含量,是目前解决TAs供求矛盾最为有效的手段,也是相关行业一致追求的目标。开展TAs生物合成途径的分子生物学研究是采用生物技术手段改造TAs生物合成途径的前提。颠茄是《中国药典》收录的TAs药源植物。近年来,随着对托品烷生物碱生物合成途径研究的不断深入,对颠茄等TAs药源植物中TAs生物合成途径中的许多相关基因进行了分离和鉴定,使通过基因工程技术在提高植物中TAs的含量成为了可能。然而,在一些TAs生物合成的关键节点,相关的研究依旧相对滞后。N-甲基腐胺的氧化脱氨是TAs生物合成的关键步骤,该反应可能是由铜胺氧化酶超家族成员N-甲基腐胺氧化酶（N-methylputrescine oxidase,MPO）催化的反应。但是编码MPO的基因还没有从TAs药源植物中克隆和鉴定,其是否参与TAs生物合成也未见报道。本研究从颠茄中克隆了两个MPO基因（AbMPO1和AbMPO2）,对其进行了生物信息学分析、组织表达模式分析,并采用RNAi技术获得了颠茄转基因发根以考察其对TAs生物合成的影响。本研究获得相关研究结果如下:1.AbMPO1和AbMPO2的克隆和序列分析利用RACE技术克隆了颠茄中的两个MPO基因的全长cDNA,分别命名为AbMPO1和AbMPO2。AbMPO1和AbMPO2的全长cDNA序列分别为2747 bp和2706 bp,其编码的氨基酸序列分别编码767个氨基酸和782个氨基酸残基。AbMPO1和AbMPO2的氨基酸序列一致性为75.3%,相似度为83.5%。AbMPO1与烟草MPO1（NtMPO1）氨基酸序列一致性为84.9%,相似度为90.1%;AbMPO2与烟草MPO1（NtMPO1）氨基酸序列一致性为75.0%,相似度为83.6%。BLASTP分析结果表明这两个MPO都属于铜胺氧化酶家族,都具有铜离子结合位点。2.AbMPO1和AbMPO2的组织表达谱分析采用实时荧光定量PCR技术,对AbMPO1和AbMPO2在颠茄须根、主根、成熟茎、幼茎、成熟叶、幼叶、花和花蕾中的表达进行了分析。结果发现,AbMPO1只在根中表达,且在须根中的表达量显著高于在主根中的表达量;数字表达谱分析结果表明AbMPO1的组织表达模式与TAs生物合成途径已经基因的表达模式一致,即在须根中高/特异表达。AbMPO2在所有检测的组织中具有表达,在根中的表达水平低于地上部分的表达水平;数字表达谱分析结果表明AbMPO2的组织表达模式与TAs生物合成途径已经基因的表达模式不一致。AbMPO1和AbMPO2组织表达谱分析结果表明,AbMPO1可能主要参与TAs生物合成。3.抑制AbMPO1导致颠茄发根中莨菪碱和东莨菪碱含量下降为进一步研究AbMPO1是否参与TAs的生物合成,采用转基因和RNAi技术获得了抑制AbMPO1的颠茄发根。PCR检测结果显示,在所有发根中均能检测到626 bp的rolC基因片段、423 bp的rolB基因片段;在iAbMPO1发根中还能够检测到521 bp的35S::iAbMPO1融合片段和597 bp的NPTII基因片段,而在对照发根中未能检测到这些片段。实时荧光定量PCR检测AbMPO1表达量的结果表明,在iAbMPO1发根中,AbMPO1的表达量显著降低,而AbMPO2的表达量没有现在变化。分子检测结果表达,获得了特异性抑制AbMPO1的转基因颠茄发根。HPLC分析TAs含量的结果发现,抑制AbMPO1大幅度降低了莨菪碱和东莨菪碱的含量。对照发根中莨菪碱含量为2.85 mg/g干重,东莨菪碱含量为1.53 mg/干重。在AbMPO1抑制的发根系中,iMPO1-7和iMPO1-8中莨菪碱为痕量,iMPO1-3、iMPO1-9和iMPO1-11中莨菪碱含量分别为0.23 mg/g干重、0.89 mg/g干重和0.65 mg/g干重;这些发根系中东莨菪碱含量为0-0.50 mg/g干重。这些结果表明,抑制AbMPO1能够大幅度降低TAs的含量,表明其参与TAs生物合成。4.抑制AbMPO2对颠茄发根中莨菪碱和东莨菪碱合成没有影响为考察AbMPO2是否参与TAs的生物合成,采用转基因和RNAi技术获得了抑制AbMPO2的颠茄发根。PCR检测结果显示,在所有发根中均能检测到626 bp的rolC基因片段、423 bp的rolB基因片段;在iAbMPO2发根中还能够检测到514 bp的35S::iAbMPO2融合片段和597 bp的NPTII基因片段,而在对照发根中未能检测到这些片段。实时荧光定量PCR检测AbMPO1表达量的结果表明,在iAbMPO2发根中,AbMPO2的表达量显著降低,而AbMPO1的表达量没有现在变化。分子检测结果表达,获得了特异性抑制AbMPO2的转基因颠茄发根。HPLC分析TAs含量的结果发现,对照发根和iAbMPO2发根中莨菪碱的含量处于无显著性差异的同一水平,东莨菪碱的含量也处于无显著性差异的同一水平。抑制AbMPO2的相关研究结果表明,AbMPO2不参与TAs的生物合成。综上所述,本研究从颠茄中克隆和鉴定了属于铜胺氧化酶家族的两个基因,AbMPO1和AbMPO2。虽然AbMPO1和AbMPO2的氨基酸序列高度相似,但其表达和在TAs生物合成中的作用完全不同。AbMPO1在颠茄具有根特异性表达特征,且在须根中表达最高,与TAs生物合成部位及TAs生物合成基因的组织表达模式一致;抑制AbMPO1导致TAs生物合成受阻;AbMPO2在组织表达模式上与TAs生物合成基因表达模式不同,抑制AbMPO2对TAs生物合成没有影响。本研究不仅确认了AbMPO1参与TAs生物合成,也为今后开展TAs的代谢工程提供了一个有价值的基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• CHAPTER 1 LITERATURE REVIEW
•   1.1 Atropa belladonna
•   1.2 Alkaloids
•   1.3 Tropane alkaloids
•   1.4 Biosynthetic pathway network of TAs and related genes
•     1.4.1 TAs and related metabolites: biosynthetic pathway
•     1.4.2 Enzymes and genes in the TA biosynthetic pathway
• CHAPTER 2 INTRODUCTION
•   2.1 Research purpose and significance
•   2.2 Scope and contents of this research
•   2.3 Technical route
• CHAPTER 3 MATERIALS AND METHODS
•   3.1 Experimental materials and reagent consumables
•     3.1.1 Plant materials
•     3.1.2 Strains and plasmids
•     3.1.3 Instruments and equipment
•     3.1.4 Kits and reagents
•     3.1.5 Preparation of conventional reagents and culture medium
•     3.1.6 Antibiotic preparation and storage method
•   3.2. General method and procedures
•     3.2.1 RNA extraction and determination
•     3.2.2 Reverse transcription of RNA
•     3.2.3 Agarose gel electrophoresis of DNA products
•     3.2.4 Recovery of the target strip
•     3.2.5 Ligation
•     3.2.6 Preparation of DH5a competent cells
•     3.2.7 Transformation of products or recombinant plasmids into DH5a competent cells
•     3.2.8 Transformation of recombinant plasmids into Agrobacterium rhizobium C58C1 competent cells
•     3.2.9 Extraction of plasmids
•     3.2.10 TPS extraction of A. belladonna genomic DNA （g DNA）
•   3.3 Cloning and analysis of Ab MPO gene
•     3.3.1 Extraction and detection of total RNA of A. belladonna
•     3.3.2 Synthesis of the first c DNA
•     3.3.3 Cloning of target gene
•     3.3.4 Acquisition of the Ab MPO gene by 5'RACE
•     3.3.5 Cloning of the full-length c DNA of the Ab MPO gene
•   3.4 Bioinformatics analysis of Ab MPO gene
•   3.5 Construction of RNAi silencing vector of A. belladonna and obtaining engineered bacteria
•   3.6 Establishment of root culture system
•     3.6.1 Activation of engineered bacteria
•     3.6.2 Transformation of A. belladonna explants by engineered Agrobacterium strains
•     3.6.3 PCR identification of transgenic A. belladonna roots
•     3.6.4 Expanded culture of transgenic A. belladonna root
•     3.6.5 Induction of hairy roots of A. belladonna by A. rhizobium C58C1
•   3.7 Gene expression analysis
•     3.7.1 Fluorescence quantitative PCR
•     3.7.2 Analysis of Ab MPO gene expression in transgenic hairy roots
•   3.8 Determination of alkaloid content in A. belladonna roots
• Chapter 4 RESULTS
•   4.1 Cloning of the Ab MPO genes from A. belladonna
•   4.2 Bioinformatics analysis of the Ab MPO gene
•     4.2.1 Multiple alignment of Ab MPO1 and Ab MPO2 amino acid sequences
•     4.2.2 Reconstruction of the Ab MPO molecular phylogenetic tree
•   4.3 Tissue profiles of Ab MPO1 and Ab MPO2
•   4.4 Construction of interference vectors p BIN19-Ab MPO1-Ri and p BIN19-Ab MPO2-Ri and transfer into C58C1
•     4.4.1 Construction of interference vector p BIN19-Ab MPO1-Ri and p BIN19-Ab MPO2-Ri
•     4.4.2 Obtaining engineered bacteria
•   4.5 Suppression of Ab MPO1/Ab MPO2 in root cultures of A. belladonna
•     4.5.1 Fluorescence q PCR detection of transgenic hair roots
•     4.5.2 Determination of alkaloids in hairy roots of transgenic A. belladonna
• Chapter 5 DISCUSSION
• Supplementary
• REFERENCES
• Acknowledgements

文章来源

类型: 博士论文

作者: Zun Lai Lai Htun

导师: 廖志华

关键词: 颠茄,甲基腐胺氧化酶,毛状根,对苯二酚生物碱

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西南大学

基金: 国家自然科学基金“WRKY类转录因子在托品烷生物碱生物合成中的调控作用研究”(31370333),国家自然科学基金“莨菪碱转运分子机理与代谢工程研究”(31770335)

分类号: Q943.2

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