大肠杆菌膜间质分子伴侣FkpA在不同温度下作用机制研究

论文摘要

β-桶外膜蛋白（outer membrane proteins,OMPs）广泛存在于革兰氏阴性细菌的外膜以及真核细胞中线粒体和叶绿体的外膜中。目前认为,β-桶外膜蛋白在核糖体中合成后经由内膜上的Sec系统转运到膜间质,在膜间质中由SurA、Skp、DegP、FkpA和PpiD等质量控制因子运送至位于外膜的BAM（β-barrel assembly machine）系统完成组装与插膜。其中分子伴侣蛋白FkpA位于大肠杆菌的膜间质区域,是一种双功能蛋白。它属于大肠杆菌细胞内肽酰脯氨酰顺反异构酶家族（PPIase）,同时具有分子伴侣活性。FkpA在细胞中的功能目前尚不明确,其截短形式的突变体是一个二聚体。本论文主要通过研究与FkpA相互作用的蛋白来探究FkpA在细胞中发挥功能的机制,并研究这些蛋白相互作用的生化基础。本研究以大肠杆菌膜间质分子伴侣蛋白FkpA为对象,运用传统的化学交联以及新近发展的非天然氨基酸介导的活细胞光交联技术,探测FkpA与底物蛋白和相关功能蛋白之间的相互作用,揭示其作用机制。本研究构建了FkpA的29个非天然氨基酸定点突变体,通过光交联技术探究不同温度下FkpA与底物蛋白质发生相互作用的区域,综合利用变性亲和层析、SDS-PAGE凝胶电泳以及Q-TOF质谱技术鉴定了与FkpA相互作用的蛋白质,同时利用一种双标签蛋白抗体筛选的方法研究活细胞中FkpA的寡聚状态。实验结果表明:1)FkpA在大肠杆菌活细胞中以二聚体作为其活性形式;2)该蛋白主要通过C端结构域和其他蛋白相互作用;3)FkpA与膜间质分子伴侣PpiD之间存在直接相互作用,且不同温度下二者作用存在一定差异,可能和它们在不同温度下的功能协同有关;4)高温下FkpA蛋白中有更多的氨基酸残基参与外膜蛋白的识别结合。这些结果为理解FkpA的功能和作用机制提供了重要启示。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 绪论
•   一、大肠杆菌膜系统
•   二、外膜蛋白的运输
•   三、大肠杆菌膜间质重要的膜间质质量控制因子
•   四、RF-Cloing技术
•   五、非天然氨基酸光交联技术
•   六、技术路线图
•   七、研究内容意义
•   八、研究方法
• 第一章 FkpA相互作用蛋白质的探究
•   第一节 实验材料
•   第二节 FkpA-His活细胞非天然氨基酸光交联实验
•   第三节 实验结果
• 第二章 FkpA二聚化作用的检测
•   第一节 实验材料
•   第二节 FkpA蛋白的表达与纯化
•   第三节 FkpA纯化蛋白的脱盐处理
•   第四节 FkpA蛋白质体外的化学交联实验
•   第五节 活细菌内蛋白化学交联情况的检测
•   第六节 活细胞内FkpA蛋白光交联复合物的二聚化鉴定
•   第七节 实验结果
• 第三章 不同温度下活细胞内FkpA与相关蛋白作用位点及光交联复合物的质谱鉴定
•   第一节 实验材料
•   第二节 FkpA蛋白在细菌体内光交联实验
•   第三节 FkpA在 ΔfkpAΔsurA背景下相互作用分析
•   第四节 光交联复合物的纯化分离与质谱鉴定
•   第五节 实验结果
• 第四章 FkpA与活细胞内底物及功能相关因子作用情况的研究
•   第一节 实验材料
•   第二节 利用光交联技术对FkpA蛋白与膜蛋白及膜间质分子伴侣蛋白作用情况鉴定
•   第三节 FkpA与底物蛋白PpiD之间的相互作用
•   第四节 活细胞内FkpA与PpiD在不同背景菌种中交联情况的研究
•   第五节 实验结果
• 第五章 结论与展望
•   结论
•   展望
• 附录1
• 附录2
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 邵和奇

导师: 付新苗

关键词: 大肠杆菌,膜间质,分子伴侣蛋白,化学交联

来源: 福建师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 福建师范大学

分类号: Q935

DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.000450

总页数: 103

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