陈楠（山东省威海市中国人民解放军四零四医院264200）
【中图分类号】R456【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）05-0039-02
聚合酶链反应(简称PCR)是一种在体外扩增特异性DNA序列的技术1985年由Mullis发明,Salki等首先应用于临床，由于它在很短时问内可使靶序列扩增2×105～106倍，具有快速、简便、灵敏、及时、对样品要求不高等优点，所以其应用范围迅猛扩大，衍生出了多种新的PCR技术，如原位PCR技术、实时定量PCR技术、NASBA、TAS等，广泛应用于临床的检验和科研工作中，并极大地完善了检验技术，在临床诊断和治疗中的意义重大，在病原体鉴定、产前诊断等方面都作出了相应的贡献。
1PCR技术的概述
PCR是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法，是分子生物学中最常用的技术。典型的PCR由①高温变形、②低温退火、③适温延伸三个步骤，作为一个循环周期，多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增，具有敏感性高、特异性强、操作简便、快速省时等特点。其灵敏度可达到Pg级，甚至达到Fg级水平，而被扩增的基因片段能与原基因片段保持不变,技术操作简便、快速而易掌握，并且对标本要求不高。用过去的方法完成一项试验少则几周，多则几个月。应用全自动扩增仪，整个过程均由电脑控制，只需数小时即可完成整个试验过程，用极微量的粗制标本就可获取目的产物.检验医学中的分子生物学技术有两种发展趋势：一是定量PCR，二是PCR的全自动化，如一次性试验卡（将应用扩增与检测融于一体），可很好地解决PCR的污染问题。
科学研究已证明，人类疾病大都直接或间接与基因有关。基因诊断被公认为实验诊断的发展方向。有专家认为，实验诊断经历了生化诊断、免疫诊断的发展阶段，正进入基因诊断的新时代。生化和免疫诊断是根据表型诊断疾病，基因诊断则是从本质上认识疾病。1995年，美国国家临床检验标准化委员会(NCCLS)发表了关于感染性疾病分子诊断应用准则的文件。该文详细论述了分子诊断应用范围、条件和质量控制细则［1］。NCCLS分子微生物委员会主席Enns断言，以基因探针和基因扩增为主的分子生物学方法将取代传统的病原体培养和生化检测方法。1998年，国际临床化学学会发布了关于分子扩增(主要指PCR)在临床诊断中应用的质量评估基础的文件。该文件肯定了PCR作为临床常规检验技术的良好发展前景，对PCR操作的各个环节进行了详细论述［2］上述两个权威性文件都特别声明，以PCR技术为主的基因扩增技术本身在不断发展变化，目前只能是确立某些原则，尚难统一规定实验室质量控制标准。
PCR的应用
在病原体鉴定方面的应用
1.1目前，嗜肺军团菌检测方法主要有分离培养、血清学试验、生化表型鉴定、脂肪酸成分分析、分子生物学检测等。分离培养法作为检测嗜肺军团菌的金标准，其特异性可达100%，但生长缓慢、耗时长、需要营养条件苛刻，不适于快速检测;血清学试验简便快速，但容易产生交叉反应现象［3］;生化表型鉴定对试剂和仪器要求简单，但只能初步鉴定一些特殊的种属［4］;肪酸成分分析相对恒定，却受细菌生长条件的影响［5］;分子生物学方法如随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)、串联重复序列(MLVA)等，虽快速、敏感，但极易污染，缺乏统一的标准［6］。
1.2结核杆菌复合群IS6110基因序列、人型结核杆菌基因序列，分别设计合成特异性引物与探针，利用实时荧光PCR对结核分枝杆菌病原菌进行检测，建立了结核病原菌的快速检测方法。该方法具有较高的灵敏性及特异性，与常用实验室检查方法痰涂片、组织活检病理的阳性率及方法差异性进行评估，明显优于传统方法，且该方法对于支气管肺泡灌洗液的检测优于痰，可以用于结核分枝杆菌检测。
1.3建立基于O抗原修饰基因的福氏志贺菌血清型PCR分型方法。针对O抗原合成基因wzx和O抗原的修饰基因gtrI，gtrIc，gtrII，oac，gtrIV，gtrV和gtrX设计引物，以常见的14种福氏志贺菌血清型（包括1a、1b、1c、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、Y、X、Xv和F6）为标准菌株，建立福氏志贺菌血清型多重PCR。
1.4特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立和优化
此外应用PCR方法从基因水平对细菌进行检测，必须正确选择所要扩增的目的基因。现提出以下方面的建议:（1）对所有检测细菌的相关基因及序列情况要了解。必要时可进行序列比较和检索。（2）根据不同的检测目的选择相应的模板。不同的菌种甚至不同的型别，其特征性基因的碱基排列顺序就可能不同。当检测不同的属、种、株及血清型时,根据序列情况，选择与之相对应特征的模板，如检测沙门氏菌所选的模板，则只能对沙门氏菌特异，而非沙门氏菌不能扩增。（3）检测同种细菌可有多个模板选择方式。既可以选择编码功能蛋白的基因，又可以选结构基因作为检测的模板。（4）可利用不同模板间的交叉限制，缩小检测范围。
2在产前诊断方面
2.1PCR后的直接检测和结合酶解法检测镰状红细胞型贫血和地中海贫血。
2.2PCR结合寡核苷酸探针的斑点杂交地中海贫血是一类常染色体隐性遗传病,源于珠蛋白基因的点突变或框架位移,迄今为止已知的突变50余种，以PCR结合等位基因特异性寡核甘酸探针(ASO)的斑点杂交是诊断地中海贫血普遍采用的方法。
2.3免疫PCR建立了一种新的抗原抗体检测系统用一种双特异性分子Streptavidin一proteinA融合蛋白，连接生物素标记的DNA和抗原抗体分子，经扩增放大可检测少到一个抗原抗体水平，此即为免疫PCR。
2.4利用PCR结合限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)的连锁分析则可用来对该病迸行产前诊断或检出携带者通过家族分析已经发现,在一些遗传疾病的遗传物质中有类似标志,如甲型血友病、色素视网膜炎、慢性舞蹈症、脆性X综合征、抗胰蛋白酶缺乏症及囊性纤维化病等应用RFLP进行连锁分析必须要有一个患病的先证者,其次先证者的母亲必须是连锁标志的杂合子方可,这也是以RFLP进行产前诊断受限制的一面。
参考文献
[1]EnnsRK，BromleySE，DaySP，etal.Moleculardiagnosticmethodsforinfectiousdiseases;approvedguideline.NatlCommitClinLabStand,1995，1-10.
[2]NeumaierM,BraunA，WagenerC.Fundamentalsofquialityassessmentofmolecularamplificationmethodsinclinicaldiagnostics(IFCCdocument).ClinChem，1998，44:12-26.
[3]史晓敏，冯珍如，隋宝环．1212例就诊患者血清抗嗜肺军团菌1～14血清型抗体水平调查［J］.临床检验杂志，2009，27(2).