利用CRISPR/Cas9和piggyBac实现果蝇基因组无缝编辑

论文摘要

CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated protein9）是第三代基因组编辑技术。在sgRNA引导下,Cas9核酸内切酶作用于特定基因组序列,产生DNA双链断裂（double-strandedbreaks,DSBs）,利用同源定向修复（homology-directedrepair,HDR）可实现对靶基因的特异性基因敲除（knock-out）或敲入（knock-in）。传统的技术方案将CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用,可实现高效的基因打靶,也易于移除打靶过程中引入的筛选标记。然而,筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列。因此,对基因组进行精确编辑的同时不引入无关序列仍有一定难度。在人工诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）的基因组编辑中,CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用的两步法策略能够实现这一目标:首先运用CRISPR/Cas9技术,利用同源定向修复原理引入基因突变及筛选标记,然后利用piggyBac转座酶将筛选标记精确移除。借鉴该方法的技术原理,本研究对果蝇（Drosophila melanogaster）CG4894基因进行了无缝编辑（seamless genome editing）,成功将该基因第18外显子上第21位的酪氨酸（tyrosine,Y）突变为半胱氨酸（cysteine,C）,且测序结果显示基因组中除设计位点之外并无其他外源序列残留。CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用策略为果蝇基因组的精确编辑提供了更多选择。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•   1.2 果蝇基因组测序
•   1.3 sgRNA质粒构建
•   1.4 供体DNA质粒构建
•   1.5 基因敲入果蝇突变体的获得
•   1.6 筛选标记基因的切除
• 2 结果与分析
•   2.1 CG4894敲入突变体的获得及鉴定
•   2.2 DsRed荧光标记的去除和鉴定
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王珏,黄娟,许蕊

关键词: 果蝇,无缝基因组编辑

来源: 遗传 2019年05期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 南京医科大学基础医学院医学遗传学系

基金: 南京医科大学引进人才启动经费项目(编号:2012RC04)资助~~

分类号: Q78

DOI: 10.16288/j.yczz.18-345

页码: 422-429

总页数: 8

文件大小: 2427K

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