陈治崔娜张媛媛王永和陈宁董楣（河北大学附属医院河北保定071000）
【摘要】目的通过给予不同生理阶段（幼年、产后）的SD大鼠二甲基苯恩(DMBA)，明确不同生理阶段这一因素是否对SD大鼠乳腺癌的发生以及肿瘤的病理特点是否存在影响。方法给予所有30只大鼠DMBA灌胃，将15只幼年大鼠分为对照组，15只成年产后SD大鼠分为实验组。对比两组之间乳腺癌的发病率、肿瘤直经、免疫组化结果。结果对于幼年SD大鼠，DMBA诱导的不同生理阶段大鼠乳腺癌发病率、肿瘤直径及免疫组化结果均有差异，且有统计学意义（P<0.05）。结论这一结果可以解释移居美国第二代乳腺癌发病率达到当地水平，而第一代却不受影响的主要原因：在于幼年时期较早的接触当地致癌因素。
【关键词】DMBA乳腺癌SD大鼠
本实验用化学致癌剂二甲基苯蒽(DMBA)诱发不同生理阶段大鼠乳腺癌动物模型。研究产后这一因素大鼠乳腺癌发生程中的干预作用。进一步明确乳腺癌的发生预防机制，早期干预防治，有针对性的降低乳腺癌的发病风险。
1材料与方法
1.1实验动物及分组
实验用健康雌性SD大鼠及所需饲料均购自河北医科大学实验动物中心。大鼠质量为70g～100g，购入后适应性饲养1周，将产后鼠及幼鼠分别分为实验组和对照组，各15只。标准饲料分笼喂养，自由饮水。
1.2试剂及实验步骤
7，12-二甲基苯蒽（7,12-dimethylbenzanthracineDMBA）：美国Sigma公司生产，大豆异黄酮：华北制药厂生产。C-erbB-2、PCNA抗体为美国Zymed公司产品，硝酸银为中国医药公司上海试剂公司生产。
动物饲养地点为河北医科大学第四医院动物实验中心（SPF级动物试验室，P3级实验室），所有实验废弃物经实验室统一分类存储、处理。
1.3模型制作
所有大鼠经适应性饲养后，将DMBA溶于食用油中，按10mg/100g大鼠体重灌胃两次，间隔10天。所有大鼠分笼饲养，给予足量水及食物。
1.4观测指标及方法
1.4.1取材
饲养至第24周，于发情间期给予2%戊巴比妥钠3-5mg/100g体重腹腔注射麻醉。记录大鼠乳腺癌发病率，测量乳腺肿物直径，将乳腺肿物及其周围约1cm范围皮肤组织一并切除。解剖大鼠乳腺肿瘤组织，常规固定并石蜡包埋，制成4μm切片，分别行嗜银染色及HE染色，光学显微镜下观察并计数细胞内核仁组成区嗜银蛋白颗粒数。AgNOR采用经典染色方法。PCNA及C-erbB-2用S-P两步法检测组织中的蛋白表达。
1.4.2指标检测方法
所有肿瘤组织均行HE染色确认。将切除肿瘤组织采用S-P法行PCNA、C-erbB-2染色。AgNOR采用经典染色法。多个乳腺肿瘤大鼠记录直径最大者，所有大鼠均经HE切片染色确认是否发病。
PCNA蛋白表达于细胞核，弱阳性呈淡黄色，中等强度表达呈棕黄色，强阳性表达呈棕褐色，在400倍光学显微镜下计数500个细胞/切片，按以下公式计算PCNA染色强度指数SII（stainingintensityindex）：（弱阳性细胞百分数×1）+（中等强度阳性细胞百分数×2）+（强阳性细胞百分数×3）；0～50为（-）、51～75为（+）、76～100为（++）、>100为（+++）。本实验以（-）～（+）为阴性，（++）～（+++）为阳性。
C-erbB-2表达于细胞膜，表达强度按HercepTest评分标准，根据阳性细胞数及着色强度分为4级：（-）完全阴性；（+），超过10%的癌细胞胞膜染色，染色间断分布，未环绕胞膜；（++），超过10%的癌细胞胞膜弱到中度阳性，染色连续，环绕整个"胞膜；（+++），超过10%的癌细胞胞膜强阳性，染色连续，环绕整个胞膜；本实验以（-）～（+）为阴性，（++）～（+++）为阳性。
AgNOR在油镜下计数至少100个细胞，直径2.5～5μ的团块按5个颗粒计算，5～10μm团块按10个颗粒计算，>10μm按15个颗粒计算。最后按单位细胞核内颗粒数计算最终平均值。
1.4.3统计学处理
使用SPSS10.0对所得数据进行处理，按α=0.05标准用t检验t＇检验、卡方检验和确切概率法进行统计分析。
2结果
2.1大体病理及组织学观察结果
对照组共有12例发病（80.0%），肿瘤直径2.75±1.21cm；实验组共有6例发病（40.0%），肿瘤直径2.68±1.41cm。两组肿瘤发病率比较差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2免疫学结果
PCNA在乳腺肿瘤组织细胞中的表达为细胞核和少数细胞的细胞质呈淡黄色。幼鼠对照组PCNA阳性表达率（66.7%）高于实验组（13.3%）且差异具有统计学意义（P<0.05）。
C-erbB-2在乳腺肿瘤组织细胞中的阳性表达位于细胞膜的棕黄色颗粒。幼鼠对照组的阳性表达率为66.7%，高于实验组20.0%，此差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3嗜银非组相关蛋白检测结果
AgNOR采用经典染色法进行核仁组成区嗜银染色计数，对照组计数：7.52±2.02，实验组计数：3.52±1.41，两组对比差异具有统计学意义（P<0.05）。
3讨论
随着医学流行病学的发展，逐步明确了乳腺癌的发生的危险因素，其中体内激素变化水平多个因素中非常重要的一方面，机体在经历成年、产后等多种体内激素的变化之后是否对乳腺癌的发病有一定的干预作用也可能从另一方面解释当前流行病学研究结果：欧美国家乳腺癌的发病率和死亡率大约是亚洲国家的四倍；同时发现，移居美国的亚裔第二代妇女乳腺癌发病率与第一代有明显差异，已经上升至当地水平；说明幼年时期的生活环境对乳腺癌发病有重要影响。也从另一个方面可以解释我国同西方乳腺癌发病率的不同原因可能源于幼年时期。
AgNOR（silver-stainingnucleolarorganizerregion）是细胞周期过程中染色变异的一种嗜银非组相关蛋白，被认为具有转录活性，能客观地反映细胞核内rRNA的转录水平及蛋白质合成水平，本实验幼鼠组嗜银蛋白表达高于产后组表明肿瘤组织增值高于对照组。PCNA又称周期蛋白，是DNA聚合酶的辅助蛋白，作用于DNA合成过程，特别是G1晚期与S期，是判定细胞增殖活性的内源性标志物，已证实PCNA的合成和表达与细胞增殖状态相关，即PCNA表达越高，细胞增生越活跃。研究表明，PCNA与乳腺癌的分期、疗效、预后有密切的关系。本实验对照组和实验组对比指标差异有显著性，说明幼鼠肿瘤预后较差。C-erbB-2(HER-2/neu)基因是原癌基因，定位于人类染色体17q12-13.32上，编码相对分子质量1.85×10的、具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,是表皮生长因子受体家族成员,在细胞信号传导中发挥重要作用,是细胞增殖、分化、移动和存活的重要调节因子。IHC与直接基因检测水平的荧光原位杂交（FISH）方法相比，检测符合率达96％。本实验采用临床最常用的IHC检测HER-2基因在细胞表面的蛋白表达水平，幼鼠的HER-2和产后组对比差异有显著性。大多数研究已表明、HER-2的改变与乳腺癌的不良预后有关，HER-2阳性者肿瘤的恶性程度较高、激素受体水平较低、肿瘤较大、多有淋巴结转移、总生存期较短，而且一旦病情复发，HER-2阳性者对激素和化疗的反应率均很低，因而HER-2又可作为对激素或化疗有否反应的预示。
本实验采用健康雌性SD大鼠，通过对比不同生理阶段DMBA诱导的大鼠乳腺癌发病率，明确产后这一因素对大鼠乳腺癌发生是否存在干预作用。通过对比发现，给予幼年SD大鼠DMBA诱导的乳腺癌发病率病理学指标均高于产后鼠。此实验提示我们：1、幼年这一特定时期对致癌因素易感性远高于成年时期；2、幼年时期恶性肿瘤分花差，恶性程度高，侵袭性明显高于产后组；3、在幼年时期予以早期干预，可能达到降低乳腺癌发病率，改善预后目的。
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