山东省泰安市零售鸭产品中产气荚膜梭菌的分离鉴定、基因分型及耐药性研究

论文摘要

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原微生物,一定条件下可引起人和动物的多种疾病。鸡和猪肉中产气荚膜杆菌的污染已经在世界范围内报道过,但是在鸭产品中却很少被报道,为了调查山东省泰安市某市场零售鸭产品中产气荚膜梭菌的污染状况以及分离株的血清型分布、耐药性和遗传演化规律,2018年3月至11月从零售市场主要的鸭产品零售商店采集鸭产品173份,环境样品10份,健康摊主的新鲜粪便7份。采集的样品经分离培养和初步鉴定后,用多重PCR鉴定分离株的血清型,通过纸片扩散法（K-B法）检测了分离株对12种（8类）常用抗菌药物的敏感性,并根据耐药表型检测了β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M、blaTEM、blaSHV和四环素耐药基因Tet（M）、TetA（P）、TetB（P）。用16SrDNA对不同来源的部分菌株的进化关系进行了初步分析,并利用多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）进一步分析了不同来源的产气荚膜梭菌的遗传相关性。分离培养结果显示:鸭产品,环境和健康人类粪便样品的产气荚膜梭菌阳性率分别为（48/173,27.70%）,（10/10,100%）和（7/7,100%）,共计分离到99株产气荚膜梭菌;血清型鉴定结果显示:所有分离株株均为A型产气荚膜梭菌;部分菌株16SrDNA序列分析结果显示:与NCBI上已上传的产气荚膜梭菌参考菌株序列的同源性为99%。毒素基因检测结果显示:在鸭源菌和人源菌中均检测到cpb2基因,阳性率分别为54.30%和33.33%,所有分离株均未检测到NetB毒素基因;肠毒素基因cpe只在人源菌株中检测到,阳性率为（1/7,14.30%）。药敏实验结果显示:90.10%的鸭源和环境分离株表现为多重耐药,耐药谱中主要包括磺胺异噁唑、杆菌肽、庆大霉素、林可霉素、红霉素、青霉素和四环素,鸭源分离株对头孢噻肟、头孢吡肟的耐药率均小于10%。在鸭源和环境分离株中检测到四环素耐药基因TetA（P）、Tet（M）和β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M,阳性率分别为（34.60%,28/81）、（22.20%,18/81）、（4.90%,4/81）;在人源菌中只检测到四环素耐药基因TetA（P）,阳性率为（66.70%,12/18）。经过初步筛选,58株不同来源的产气荚膜梭菌被用于多位点序列分型（MLST）,20组从NCBI上下载的健康儿童肠道分离株ST序列（ST45-ST64）也被用于分型。分型结果显示:58株产气荚膜梭菌产生了41个ST型和4个克隆复合群（CC1-CC4）,4个克隆群占总菌株数的37.9%,其中CC1包括来自于四个零售商的肠内容物分离株、胴体分离株以及环境分离株,共计14个菌株,占总菌株的24.13%,是一个优势克隆复合群,其中又以ST11型最为常见,占总菌株的8.60%;部分人源分离株和鸭源分离株被分配在同一ST型（ST6）中。添加了ST45-ST64后,产生了3个新的克隆复合群（CC5-CC7）,鸭源分离株和儿童分离株同时被分配到同一克隆群中。结论:泰安市鸭产品中产气荚膜梭菌的污染率较高,鸭源和环境分离株均为A型产气荚膜梭菌且分离株表现出广谱耐药性,多重耐药率高达90.10%;45株鸭源和环境分离株表现出了丰富的遗传多样性,产生了33个ST型和4个克隆复合群（CC1-CC4）;MLST结果显示:可能存在交叉污染,并且零售商环境和鸭肠内容物是导致胴体污染的主要原因;鸭源、人源宿主的部分菌株系统发育关系相近,被分配同一个ST型或克隆群中,表明鸭源菌存在通过食物链传播给人类的风险。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
•   1.1 产气荚膜梭菌基本概况
•     1.1.1 产气荚膜梭菌在自然界的分布
•     1.1.2 产气荚膜梭菌的形态特征及培养特性
•     1.1.3 产气荚膜梭菌血清分型
•   1.2 食源性产气荚膜梭菌流行状况
•   1.3 抗生素在防治产气荚膜梭菌上的应用及危害
•     1.3.1 抗生素的分类及作用机制
•     1.3.2 产气荚膜梭菌耐药现状
•   1.4 产气荚膜梭菌耐药机制
•   1.5 食源性产气荚膜梭菌致病机制及毒素基因研究进展
•   1.6 产气荚膜梭菌分子分型方法
•   1.7 研究目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 样品采集
•     2.1.1 样品来源
•     2.1.2 其他菌株的来源
•     2.1.3 主要实验试剂
•     2.1.4 主要溶液及培养基的配置
•     2.1.5 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 样品的处理
•     2.2.2 菌株的分离纯化
•     2.2.3 产气荚膜梭菌的初步鉴定
•     2.2.4 菌种的保存
•     2.2.5 血清分型和毒素检测
•       2.2.5.1 血清型鉴定
•       2.2.5.2 cpb2（beta2）的PCR检测
•     2.2.6 抗菌药物敏感试验
•     2.2.7 耐药基因的检测
•     2.2.8 产气荚膜梭菌16SrDNA序列分析
•     2.2.9 产气荚膜梭菌的多位点序列分析
•       2.2.9.1 管家基因引物合成
•       2.2.9.2 管家基因的PCR扩增和测序
•       2.2.9.3 多位点序列分型和系统发育分析
• 3 实验结果与分析
•   3.1 阳性率统计
•   3.2 血清分型和毒素基因检测
•     3.2.1 PCR初步鉴定结果
•     3.2.2 保存效果的验证结果
•     3.2.3 产气荚膜梭菌血清型和毒素基因鉴定结果
•       3.2.3.1 分离株血清型鉴定结果
•       3.2.3.2 产气荚膜梭菌分离株 cpb2 毒素基因检测
•       3.2.3.3 分离株cpe毒素的检测结果
•       3.2.3.4 分离株NetB和 Tpel基因的PCR检测结果
•   3.3 抗生素敏感性检测结果
•   3.4 MLST菌株的筛选
•   3.5 耐药基因检测结果
•     3.5.1 四环素耐药基因检测结果
•     3.5.2 β-内酰胺类耐药基因检测结果
•   3.6 分离株遗传演化规律及溯源分析结果
•     3.6.1 产气荚膜梭菌16SrDNA序列分析结果
•   3.7 等位基因分析
•   3.8 ST型和克隆复合物
•   3.9 遗传关系分析
•     3.9.1 最小生成树的绘制
•     3.9.2 系统发育树的绘制
• 4 讨论
•   4.1 山东泰安地区零售鸭产品中产气荚膜梭菌污染状况及血清型分布
•   4.2 鸭产品中携带的产气荚膜梭菌的耐药特性和耐药基因检出情况
•   4.3 分离株多位点序列分型和遗传相关性分析
•   4.4 分离株毒素基因检出情况
• 5 结论
• 6 创新点
• 参考文献
• 7 附录
• 8 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘煜

导师: 王海荣

关键词: 鸭产品,产气荚膜梭菌,耐药性,多位点序列分型,系统发育关系

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,农业科技

专业: 生物学,轻工业手工业,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

分类号: TS251.7;S852.61

总页数: 86

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