两株特殊生境微生物次级代谢产物及倍半萜合酶的研究

论文摘要

微生物天然产物是新药研发的重要来源,其中特殊生境微生物在各种环境胁迫因素的影响下,能产生更多结构新颖、生物活性独特的天然产物。采用基因组导向的天然产物挖掘策略,运用基因组学、生物信息学、天然产物化学和合成生物学等多学科交叉融合手段,对特殊生境微生物进行新颖基因的挖掘和新颖天然产物结构的鉴定,能够避免大量已知化合物的重复发现,为天然产物研究提供新的机遇。本论文对实验室自主构建的植物病原真菌和海洋放线菌的基因组库进行生物信息学分析,通过antiSMASH网站进行基因簇预测和分析,从中选取次级代谢产物较为丰富的植物病原真菌麦根腐平脐蠕孢菌Bipolaris sp.11134和海洋疣孢菌Verrucosispora sp.MS1003菌作为研究对象,通过单菌多产物策略（OSMAC）激活生物合成基因簇,研究新的代谢产物结构,并对真菌中倍半萜合酶及其环化机制进行研究。从麦根腐平脐蠕孢菌Bipolaris sp.11134中分离得到6个seco-sativene类倍半萜化合物（1-6）,其中包括3个新化合物sesquisorokins A-C（1-3）。Seco-sativene类化合物含有独特的双环[3.2.1]桥环结构,该类型结构的生物合成机制尚未报道。从可能的生物合成机制分析,发现其包含罕见的裂环机制,因此本论文进一步对其关键合酶展开了相关研究。利用生物信息学分析发现了Bipolaris sp.11134的基因组中含有4个潜在的倍半萜合酶基因序列,结合其所在的基因簇深入分析,通过构建酿酒酵母、大肠杆菌、构巢曲霉三种异源表达体系对潜在倍半萜合酶进行体内异源生产,鉴定环化产物的结构以及体外酶学催化实验表征倍半萜合酶的功能,并进一步结合已经鉴定的倍半萜化合物化学结构,推测其生物合成途径。此外,比较基因组学分析显示,海洋疣孢菌Verrucosispora sp.MS1001 37与能够产生具有抗MASR活性的abyssomicin类化合物的V.maris AB-18-032含有相同的生物合成基因簇,在进行基因簇注释时发现其含有尚未有功能鉴定的黄素依赖的环氧化酶,本论文通过OSMAC发酵和LC-MS实验进一步挖掘Verrucosispora sp.MS10037的次级代谢潜力,通过放大发酵、分离纯化共得到7个化合物（7-13）,综合运用高分辨质谱、核磁共振和圆二色谱等多种现代波谱学技术,鉴定为4个abyssomicin类化合物（7-10）和3个proximicin类化合物（11-13）,其中abyssomicin Y（7）是abyssomicin类化合物结构中C8和C9位上的双键被环氧基团取代的新化合物,进一步的基因功能鉴定正在进行中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 天然产物药物研究的重要意义
•     1.1.1 天然产物是药物研究的重要来源
•     1.1.2 微生物天然产物研究的瓶颈和挑战
•   1.2 基因组导向挖掘天然产物的研究现状
•   1.3 真菌来源倍半萜类化合物及倍半萜合酶研究进展
•     1.3.1 真菌来源倍半萜类化合物及其活性
•     1.3.2 真菌来源倍半萜合酶的多样性研究进展
•   1.4 研究意义及内容
• 第二章 植物病原真菌Bipolaris sp. 11134次级代谢产物研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 实验仪器
•     2.2.2 菌株信息
•     2.2.3 主要实验试剂
•     2.2.4 主要培养基及分离材料
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 菌株鉴定方法
•     2.3.2 菌株发酵培养方法
•     2.3.3 活性测试方法
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 Bipolaris sp. 11134菌株鉴定
•     2.4.2 Bipolaris sp. 11134放大发酵、倍半萜产物分离及其结构鉴定
•     2.4.3 单体化合物生物活性的初步评价
•     2.4.4 Bipolaris sp. 11134化合物的物理常数与波谱数据
•   2.5 小结和讨论
• 第三章 植物病原真菌Bipolaris sp.11134倍半萜合酶鉴定和生物合成途径初步预测
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料及方法
•     3.2.1 实验仪器
•     3.2.2 菌株、质粒和引物
•     3.2.3 培养基
•     3.2.4 常用试剂及溶液
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 目的基因片段的PCR扩增
•     3.3.2 表达载体构建
•     3.3.3 构巢曲霉原生质体的制备与转化
•     3.3.4 大肠杆菌蛋白表达及纯化
•     3.3.5 密码子优化
•     3.3.6 构巢曲霉和酿酒酵母菌株发酵与培养
•     3.3.7 生物信息学分析
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 基于生物信息学分析Bipolaris sp.11134倍半萜合酶
•     3.4.2 基于构巢曲霉底盘的倍半萜合酶异源表达
•     3.4.3 基于酿酒酵母底盘的倍半萜合酶异源表达
•     3.4.4 基于大肠杆菌底盘的倍半萜合酶异源表达
•     3.4.5 Bipolaris sp.11134倍半萜生物合成途径初步推测
•   3.5 小结和讨论
• 第四章 疣孢菌Verrucosispora sp. MS100137的化合物分离和鉴定
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 实验仪器
•     4.2.2 菌株信息
•     4.2.3 主要实验试剂
•     4.2.4 主要培养基及分离材料
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 菌株鉴定方法
•     4.3.2 发酵培养方法
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 Verrucosispora sp. MS100137菌株鉴定
•     4.4.2 Verrucosispora sp. MS100137放大发酵、次级代谢产物分离及其结构鉴定
•     4.4.3 生物合成途径的初步预测
•     4.4.4 Verrucosispora sp. MS100137化合物的物理常数与波谱数据
•   4.5 小结和讨论
• 第五章 结论
•   5.1 总结
•   5.2 创新性和意义
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李碧霄

导师: 张立新,刘雪婷,张敬宇

关键词: 基因组挖掘,植物病原真菌,海洋疣孢菌,深海霉素

来源: 安徽大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 安徽大学

分类号: Q936

总页数: 171

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