摘要：阿霉素是一种抗瘤谱极广的抗癌药物，有着较强的心脏毒性，现已提出多种适合方案提高靶向性，减少对正常组织的毒害，被广泛应用于临床治疗癌症。然而在制备方面目前广泛采用的是产率低、成本高、周期长的半化学方法。为了更高效低成本的生产阿霉素，生物合成思路受到广泛地关注。本文主要借助前人对相关基因序列的研究报告，浅析提取纯化相关基因并构建II 型聚酮合酶的多基因载体的基因工程方面操作思路。
关键词：阿霉素；基因工程；合成生物学；抗癌
1 阿霉素与基因工程简介相关简介
1.1阿霉素的发展现状
阿霉素（Doxorubicin，又称hydroxyldaunorubicin、多柔比星，商品名称是Adriamycin），是一种作用于DNA 的药物，广泛使用于化学治疗。属于蒽环类（Anthracycline）抗生素，因其抗瘤谱较广，常被应用于治疗白血病、胃癌、肺癌、甲状腺癌多种癌症。最早于20 世纪50 年代Farmitalia 实验室和另一组法国研究人员发现了一种抗癌物质并命名为“道诺毒素”（daunorubicin）。在20世纪60 年代开始临床试验，成功治疗了急性白血病和淋巴瘤，然而同时期被确认有致命的心脏毒性。后经Farmitalia 实验室改进形成了最原始的阿霉素。据统计，目前有超过2000 种已知的阿霉素类似物 [1]。
阿霉素通过插入DNA 与之相作用，引发拓扑异构酶对DNA三级结构的破坏，抑制DNA 的复制，从而抑制肿瘤细胞的增生。尽管阿霉素有包括引起嗜中性白血球缺乏症、扩张性心脏病、充血性心力衰竭甚至死亡的副作用，但凭借其突出的抗癌优势，仍为全世界治疗癌症的优先选择之一。
目前阿霉素的主要工业生产方式为半化学合成。即通过生物发酵先获取中间产物，再通过分离结晶发酵液，得到较纯净中间产物，以化学合成的方法再加工，实现阿霉素的合成。其原理为通过菌种发酵获取中间产物柔红霉素，在10 摄氏度下，加入原甲酸三乙酯的反应环境里，使用溴二氯甲烷氯化。所得产物借助丙酮-氢溴酸在室温下发生脱缩酮反应得到溴化柔红霉素。再于40 摄氏度的酸性反应环境中与甲酸钠反应，逐步得到粗制阿霉素，最后经过分离提纯得到较纯阿霉素[2]。整个过程周期长，难度大，污染环境，操作复杂，收率低，造成阿霉素生产成本偏高。阿霉素有着极高经济价值却在生产上寸步难行，由此促进了另一角度的合成思路--生物合成。
目前通过对阿霉素各环节作用机制的研究，人们不断深入了解其作用。并为研究新抗癌药提供全新的靶点与依据。且近来已有学者设计了作用于阿霉素所引起副作用的过程中关键分子的抑制剂，不断努力探索降低其毒性、减小副作用的方法，也在临床上采用多种机制解决耐药性问题。在各方面持续成功的研究探讨中，阿霉素的临床应用前景会变得更为广阔。
山药又名白苕、薯蓣、大薯，是薯蓣属一年生或多年生缠绕藤本植物，以其地下肥大的块茎或圆柱状茎供食用。山药的生长期长、农本投入大、栽培费工，在栽培中要求土壤土层深厚肥沃，江苏省主要在苏北徐淮地区栽种。由于山药的营养丰富，可药食兼用，既是可口的蔬菜、又是滋补的良药，深受国内外广大消费者青睐。
1.2基因工程
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1.3基因工程大体操作流程
目前基因工程一般包括四个步骤：首先可以直接通过限制性核酸内切酶对完整DNA 链条切割并通过电泳等方式筛选，再利用PCR 技术扩增目的基因。若已经知道目的基因核苷酸序列，也可以化学方法直接人工合成。另外如果目的基因已被较充分研究，也可直接于基因库中寻找并扩增使用。然后进行构建基因的表达载体，将目的基因导入受体细胞。最后进行目的基因的检测与鉴定：此步骤主要通过DNA 分子杂交技术、抗原-抗体杂交和个体生物学水平鉴定的方法实现。基因工程在医学领域应用于药品生产、研究模型和基因治疗；工业领域应用于生产食物、原料、清理有毒废物等；农业上应用于耐病虫害、提高作物价值、强化植株等。各领域都有广泛应用和光明前景。
2 阿霉素的生物合成简介
2.1阿霉素的合成途径现状
首先通过双酶切处理质粒，然后连接所得质粒片段和新的载体并进行热转化，再经菌落PCR 筛选获取所需重组质粒。另外可使用小牛肠碱性磷酸酶处理质粒，以减少连接过程中的自连情况。连接所提取基因片段与开环质粒并进行热转化，热转化方法与前文相同 [5]。
基因工程是指通过生物技术操纵有机生物体基因组从而改变细胞遗传物质的技术。可以按照人类的愿望设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型。最早于1973 年，保罗伯格将λ 病毒的DNA 与猴病毒SV40 中的DNA 结合，诞生了第一个重组DNA 分子[3]。次年斯坦利科恩和赫伯特博耶将抗生素的抗性基因成功插入到大肠杆菌的质粒中，由此产生了第一个转基因生物。一年后鲁道夫耶尼诗将外来的DNA 引入一种小鼠的胚胎中，创建了第一只转基因动物 [4]。人们逐渐利用基因工程生产人胰岛素等各种药物，并培育各种转基因动植物。
2.2构建阿霉素关键合成酶基因的单基因表达载体
利用软件设计目的基因的相应引物并通过第三方公司合成。将引物稀释后与目的基因、所需酶等配比制作溶液进行PCR。结束后使用PCR 产物回收提纯试剂盒回收纯化扩增后的目的基因。实验室利用琼脂糖凝胶电泳对所提取的质粒和基因片段质量进行测评，电泳结束后在凝胶成像仪中观察并分析相应条带。利用相应DNA 连接酶连接切过并纯化的基因片段和质粒片段，再进行热转化，使已连接的基因片段转化到处于感受态的E.coli BL21(DE3)中，然后经过菌体浓缩和培养得到转化的大肠杆菌单菌落。取已培养好的大肠杆菌单菌落，利用PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳进行观测验证，以筛选阳性菌后期克隆。为保证后续实验的正确进行，筛选结果被送至专业公司测序，再次确认。采用M9 培养基，保证大肠杆菌对pH、营养物质等的需求，额外添加适量抗生素后将鲜菌液转接至培养基上，在摇床培养箱中培养一段时间。此时再次使用琼脂糖凝胶电泳对菌体进行电泳分析，以测试所导入异源基因的表达情况。对电泳后的结果染色，脱色后观察结果 [5]。
随着代谢工程不断发展，人们有越来越多的有效手段可以将底物转化为所需产品。而复杂产物转化的关键是多个基因的协同表达。pET-28a 作为一种已商业化的载体，可以在大肠杆菌中进行异源表达。实验室对其改造后，构建了全新的pBD 表达载体。在新载体中可以利用Spe I 与Xba I 的同尾酶构建多基因表达载体，达成克隆目的。在适宜的培养条件下培养数天，即可获得链霉菌S.peucetius ATCC 27952 菌体，随后通过细菌基因组提取试剂盒提取菌体基因组，并放入冰箱适宜温度下保存。
2.3构建阿霉素前期合成关键--II型聚酮合酶的多基因表达载体
核心过程主要为以下两点：（1）构建阿霉素关键合成酶基因的单基因表达载体；（2）构建阿霉素前期合成关键--II 型聚酮合酶的多基因表达载体；目前应用于市场的阿霉素生产主要通过半化学合成的方法，大致原理是先利用特定菌种经过生物发酵方法产生中间体--柔红霉素，再通过分离结晶发酵液提取中间体，最后通过十分复杂的多种化学反应将柔红霉素转化成柔红霉素盐，再水解得到粗制阿霉素，然后逐步提纯得到精制阿霉素。由于整个过程周期长、过程复杂且要兼顾各功能区域的化学性质，所以总收率一般只有不到33%，使得阿霉素生产成本居高不下。
2.4探究阿霉素的生物合成途径意义
人类科技水平的不断进步使生活更高效、便利的同时也带来了不小的危害，如今的人们暴露在各种或隐性或显性的致病因子下，从吃下去的亚硝酸盐、苯并芘，到各种工业排放、杀虫剂，甚至是不规律的作息，都拉进了人类与癌症的距离。阿霉素作为少数极为有效的广谱抗肿瘤药物由此有着极高地位，然而传统制造工艺周期长、不稳定、污染严重、成本高极大程度限制了阿霉素的进一步研究和推广应用。所以生物合成阿霉素凭借着低成本、低污染、高收率的优点，很有希望成为未来新型阿霉素制作工艺，造福诸多患者。本文概括性探究了目前生物合成阿霉素关键技术即基因工程，获取阿霉素合成同路核心蛋白--II 型聚酮合酶的相关基因，在分析构建单个关键基因表达载体后组合构建多基因表达载体，最后就是导入工程菌进行检验了，暂不赘述。该过程运用的商业化质粒、PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳、酶切、热转化等技术皆为已被广泛应用的技术，工业转化门槛相对较低。生物合成技术作为相对高效的产物转化技术，在抗癌药物方面的发展亦是开拓了新的思路，发展空间广阔，发展前景乐观。
2.5探究阿霉素生物合成途径中的反思与进一步探究方向
阿霉素合成通路上的关键基因尚未报道完全，部分尚未明确基因序列的催化酶或需寻找替代品。II 型聚酮合酶作用机理尚未完全明确，存在一定程度的导入后无法正常表达情况。所选工程菌自然生命活动与阿霉素表达通路有一定拮抗作用，一定程度上会互相抑制。
3 结语
目前阿霉素是治疗癌症最有效的手段之一，人类也在不断地进行减弱其副作用的研究。相信生物合成阿霉素能早日实现工业化，取代现有效率低下的生产方式，为人类抗击癌症、研究新药物提供丰富的原料与支持。
其次，根据公立医院的发展目标和战略愿景，全面预算管理的运用是对日常的运营管理进行系统的规划，从而促进预算的合理性运用，另一方面，在管理上得到加强的同时可以有效地对部门相关工作人员进行监督，并及时发现存在的不足，并采取有效的手段进行处理，因此可以保证在工作进程中有序展开相关的项目，并可以严格控制预算，保障公立医院的效益管理。
参考文献
[1]Weiss R B.蒽环霉素:我们会找到更好的阿霉素吗?[J].肿瘤学研讨会,1992,19(6):670-686.
[2]刘陈才. 阿霉素合成途径关键酶基因的异源表达[D]. 2016.
[3]Jackson DA,Symons RH,Berg P.将新的遗传信息插入猿猴病毒40 DNA的生化方法:含有λ 噬菌体基因的圆形SV40 DNA 分子和大肠杆菌的半乳糖操纵子[J].美利坚合众国国家科学院院刊,1972,69(10):2904-2909.
[4]Jaenisch R,Мintz B. Simian 病毒40 个DNA 序列在健康成年小鼠的DNA中来自注射病毒DNA 的植入前囊胚[J].美 利坚合众国国家科学院院刊,1974,71(4):1250-1254.
[5]李笑寒. 抗癌药阿霉素关键合成酶基因的串联异源表达研究[D]. 2018.
中图分类号：R73
文献标识码：B
DOI:10.19613/j.cnki.1671-3141.2019.86.083
本文引用格式：高嘉志,侯朋远.浅析利用合成生物学方法生产阿霉素[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(86):152-153.
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