果蝇how基因生物学功能的初步研究

论文摘要

大量研究表明RNA结合蛋白在生殖细胞发生过程中扮演者重要角色,它通过调控RNA的各种活动,在转录和转录后水平影响基因表达。果蝇how基因编码产物为RNA结合蛋白,现在有许多研究结果表明该蛋白参与果蝇体内多种活动进程,如肌肉细胞的迁移、类固醇代谢、心率控制、性别决定以及中胚层分裂等等。本文主要研究held out wings（how）基因在生殖细胞中的功能,以及LC结构域对HOW蛋白聚集的影响。首先,我们通过原核纯化HOW蛋白免疫小鼠,获得了 HOW蛋白鼠源抗体并通过Western Blot和免疫荧光染色分析了 HOW蛋白的表达情况。然后我们制备了 how基因敲低的转基因果蝇,发现在其生殖细胞中特异性敲低how基因后,果蝇生殖干细胞丢失,并且随着果蝇发育最终引起生殖细胞的全部丢失。接下来,我们研究了 LC结构域对HOW蛋白的影响,我们发现LC结构域不影响HOW蛋白在细胞中的定位。进一步的通过半变性凝胶电泳试验,我们发现HOW蛋白的LC结构域（QA-Rich）在很大程度上影响了该蛋白在体外的聚集,但是这种聚集与蛋白质之间二硫键的形成没有太大关系。在体外进行的蛋白质相变试验表明LC结构域缺失后HOW蛋白无法在体外形成规则的液滴状颗粒,从而进一步验证了 LC结构域对HOW蛋白的聚集有一定的影响。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
•   1.1 果蝇生殖干细胞
•     1.1.1 果蝇雌性生殖干细胞
•     1.1.2 果蝇雄性生殖干细胞
•   1.2 基因编辑技术概况
•     1.2.1 ZFNs介导的基因编辑
•     1.2.2 TALENs介导的基因编辑
•     1.2.3 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑
•   1.3 RNA结合蛋白的研究进展
•   1.4 本研究的目的及意义
• 2 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 果蝇品系
•     2.1.2 实验所用质粒载体
•     2.1.3 实验所用菌株
•     2.1.4 实验所用细胞
•     2.1.5 实验所用主要试剂
•     2.1.6 实验所用主要引物
•     2.1.7 溶液的配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 Cas9/sgRNA方法制备突变体果蝇
•     2.2.2 转基因果蝇品系构建
•     2.2.3 用QIAGEN Plasmid Mini Kit中提质粒
•     2.2.4 Inoue法制备DH5α感受态细胞
•     2.2.5 构建载体
•     2.2.6 质粒小量提取
•     2.2.7 原核蛋白表达及其纯化
•     2.2.8 质粒大量提取
•     2.2.9 细胞的培养与转染
•     2.2.10 半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳法（SDD-AGE）
•     2.2.11 蛋白质相变（Protein Phase Separation）
•     2.2.12 Trizol法提取蛋白质
•     2.2.13 蛋白免疫印迹实验（Western Blot）
•     2.2.14 果蝇基因组DNA提取
•     2.2.15 果蝇卵巢和睾丸的免疫组织化学染色
• 3 实验结果
•   3.1 果蝇HOW抗体的制备及HOW蛋白的表达分析
•   3.2 how基因沉默后造成生殖细胞丢失
•   3.3 LC结构域的存在不影响HOW蛋白在细胞中的定位
•   3.4 LC结构域影响HOW在细胞内聚集
•   3.5 LC结构域影响HOW蛋白在体外相变
•   3.6 利用CRISPR/Cas9系统构建how突变体
• 4 讨论
•   4.1 how基因对果蝇的生长发育是不可缺失的
•   4.2 how基因对果蝇生殖器官的发育是不可缺失的
•   4.3 LC结构域不影响HOW蛋白在细胞内定位
•   4.4 HOW蛋白在体外有聚集现象
•   4.5 LC结构域对于其聚集发挥着一定作用
• 5 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵媛媛

导师: 陈大华

关键词: 蛋白,结合蛋白,生殖细胞,结构域,聚集

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 安徽农业大学

分类号: Q78

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000139

总页数: 82

文件大小: 5745K

下载量: 35