cyaA基因对绵羊肺源肠外致病大肠杆菌XJ10毒力的影响研究

论文摘要

肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal Pathogenic E.coli,ExPEC）能引起人和动物脑膜炎、败血症、泌尿道感染、肺炎等疾病,导致动物较高的死亡率。研究发现ExPEC的毒力与其携带的毒力因子密不可分。由cyaA基因编码的环腺苷酸合成酶（Adenylate Cyclase,AC）可以催化ATP形成的环腺苷酸（Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP）与其受体蛋白结合可调节大肠杆菌（E.coli）近50%的包括毒力因子在内的基因的转录。作者所在实验室从表现为严重呼吸道感染死亡的羊肺脏组织中分离鉴定得到10株ExPEC（XJ01-XJ10）,并在XJ10菌株中检测到cyaA基因。目的:为研究cyaA基因对XJ10毒力及其他特性的影响,本论文通过构建cyaA基因的缺失株和互补株,分析cyaA基因对XJ10 BF形成能力、细胞黏附和侵袭能力以及LD50等的影响。方法:（1）采用同源重组的方式构建XJ10的cyaA基因缺失株;扩增cyaA全长并克隆至pHSG396质粒得到pHSG396-cyaA重组质粒,将其电转入缺失株的感受态细胞中,筛选正确的互补株,对3株菌的菌落形态和生长曲线进行观察。（2）应用实时荧光定量PCR检测cyaA基因对XJ10碳源利用和黏附侵袭相关基因的转录调控影响;采用96孔细胞板培养细菌结合结晶紫染色法定性和定量菌株BF的形成能力,寇氏标准法测定LD50检测cyaA基因对XJ10毒力的影响。（3）通过活菌计数的方式检测cyaA基因在XJ10对TC-1细胞黏附和侵袭能力的影响;采用实时荧光定量PCR法检测不同菌株人工感染小鼠后肺脏紧密连接和基膜相关基因表达情况。结果:（1）成功构建XJ10的cyaA基因缺失株XJ10-ΔcyaA和互补株cyaA+/ΔcyaA,3株菌的菌落形态一致,但XJ10-ΔcyaA利用乳糖的能力下降且生长速率显著低于XJ10;cyaA+/ΔcyaA的乳糖利用能力与生长速率虽低于XJ10,但要高于XJ10-ΔcyaA。（2）与XJ10相比,XJ10-ΔcyaA碳源利用和黏附侵袭相关的8种基因转录水平下调,其中gltA、fabB和pap基因的表达量差异显著（P<0.05）,sucC、acs、fyuA、luxS和motA基因表达量差异不显著（P>0.05）;XJ10-ΔcyaA只在第12和24 h形成了BF的碎片,未见明显BF网状结构,cyaA+/ΔcyaA的BF形成规律与XJ10的一致,但形成的BF形态较为松散稀疏;XJ10-ΔcyaA的LD50较XJ10升高了1.8倍,差异显著（P<0.05）,cyaA+/ΔcyaA的LD50较XJ10-ΔcyaA下降了1.3倍。（3）XJ10-ΔcyaA对TC-1细胞的黏附菌数少于XJ10,差异显著（P<0.05）,cyaA+/ΔcyaA的黏附菌数少于XJ10但多于XJ10-ΔcyaA,差异显著（P<0.05）;与XJ10相比XJ10-ΔcyaA对TC-1的侵袭菌数在各个时间点均减少,差异显著（P<0.05）,cyaA+/ΔcyaA菌株各个时间点的侵袭菌数少于XJ10,但多于XJ10-ΔcyaA且差异均显著（P<0.05）;在48 h时3株菌的occluding、zo-1和mmp-9的mRNA表达量均达到峰值,与XJ10相比,XJ10-ΔcyaA的occluding、zo-1 mRNA表达量减少,差异均显著（P<0.05）,mmp-9的mRNA表达量也增加,差异显著（P<0.05）。结论:（1）cyaA基因缺失降低了XJ10的生长速率和对乳糖的利用能力。（2）cyaA基因缺失导致XJ10碳源利用和黏附侵袭相关基因的转录水平下调,降低了BF形成能力和毒力。（3）cyaA基因缺失减少了XJ10对TC-1细胞的黏附和侵袭能力,同时也降低了感染XJ10后小鼠的肺脏紧密连接和基膜相关基因的转录水平。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 外文缩略词表
• 第一章 绪论
•   1 研究目的与意义
•   2 国内外研究进展
•     2.1 致病性大肠杆菌的研究进展
•       2.1.1 大肠杆菌生长培养特性
•       2.1.2 大肠杆菌的生化特性
•       2.1.3 大肠杆菌的主要抗原
•       2.1.4 肠外致病大肠杆菌的危害
•       2.1.5 肠外致病大肠杆菌的毒力因子
•     2.2 腺苷酸环化酶的研究进展
•       2.2.1 腺苷酸环化酶（Adenylate Cyclase,AC）
•       2.2.2 cAMP受体蛋白
•       2.2.3 cAMP与其受体蛋白间的作用机制
•   3 研究内容
• 第二章 试验内容
•   试验一 XJ10的cyaA基因缺失株及互补株的构建
•     1.材料和方法
•       1.1 材料
•     1.1.1 菌株与质粒
•     1.1.2 引物
•     1.1.3 试验仪器
•     1.1.4 试验试剂
•     1.1.5 试验试剂配制
•       1.2 方法
•     1.2.1 XJ10中cyaA基因的PCR扩增检测
•     1.2.2 XJ10的cyaA基因的克隆鉴定
•     1.2.3 cyaA打靶片段的构建及鉴定
•     1.2.4 供体菌的构建
•     1.2.5 接合实验及cyaA基因缺失菌株筛选
•     1.2.6 互补株的构建
•     1.2.7 菌落形态及生长曲线及部分生化的鉴定的检测
•     2.结果
•       2.1 XJ10中cyaA基因扩增结果
•       2.2 cyaA打靶片段的融合结果
•       2.3 cyaA基因缺失株的筛选结果
•       2.4 互补株的构建结果
•       2.5 菌落形态观察结果
•       2.6 生长曲线的测定结果
•       2.6 生化鉴定结果
•     3.讨论
•       3.1 构建大肠杆菌基因突变株的方法的选择
•       3.2 cyaA基因对XJ10 生长特性的影响
•     4 小结
•   试验二 cyaA对 XJ10 碳源利用、黏附侵袭相关基因mRNA水平、BF形成能力以及LD50 影响的研究
•     1.材料和方法
•       1.1 材料
•     1.1.1 菌株与动物
•     1.1.2 试验仪器
•     1.1.3 试验试剂
•     1.1.4 试验试剂的配制
•       1.2 方法
•     1.2.1 cyaA基因对XJ10 的部分基因mRNA表达水平影响
•     1.2.2 生物被膜形成能力试验
•     1.2.3 LD50 的测定
•     2.结果
•       2.1 cyaA基因对XJ10的8 种基因m RNA表达水平影响
•     2.1.1 碳源利用相关基因m RNA表达量测定结果
•     2.1.2 黏附侵袭相关基因m RNA表达量测定结果
•       2.2 生物被膜形成能力试验结果
•     2.2.1 BF形态结构观察试验结果
•     2.2.2 BF生长曲线检测结果
•       2.3 LD50 测定的试验结果
•     3 讨论
•       3.1 cyaA基因对XJ108 种基因的调控的影响
•       3.2 cyaA基因对BF形成的影响
•       3.3 cyaA基因对细菌毒力的影响
•     4.小结
•   试验三 cyaA基因对XJ10 细胞黏附、侵袭及对小鼠肺部紧密连接和基膜基因mRNA水平影响的研究
•     1.材料方法
•       1.1 材料
•     1.1.1 菌株与细胞
•     1.1.2 试验仪器
•     1.1.3 试验试剂
•     1.1.4 试验试剂的配制
•       1.2 方法
•     1.2.1 TC-1 细胞的复苏
•     1.2.2 细菌感染液的准备
•     1.2.3 XJ10 人工感染小鼠
•     2.结果
•       2.1 XJ10、XJ10-ΔcyaA和 cyaA+/ΔcyaA对 TC-1 细胞黏附结果
•       2.2 XJ10、XJ10-ΔcyaA和 cyaA+/ΔcyaA对 TC-1 细胞侵袭结果
•       2.3 occluding、mmp-9和zo-1的mRNA表达量的变化研究结果
•     2.3.1 occluding基因的mRNA表达量结果
•     2.3.2 mmp-9 基因的mRNA表达量结果
•     2.3.3 zo-1 基因的mRNA表达量结果
•     3.讨论
•       3.1 细胞的选择
•       3.2 cAMP对细胞的黏附与侵袭的影响
•       3.3 肺部紧密连接与基膜与致病力的关系
•     4.小结
• 全文总结
• 论文创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介
• 石河子大学硕士研究生学位论文 导师评阅表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 柴迎锦

导师: 周霞,钟发刚

关键词: 绵羊肺大肠杆菌,基因,细胞黏附和侵袭,生物被膜,毒力基因

来源: 石河子大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 石河子大学

分类号: S852.61

总页数: 77

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