重组鸭α-干扰素的表达与鉴定

论文摘要

根据大肠杆菌密码子的偏好性,试验对GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列进行密码子优化,人工合成后构建原核表达质粒pET30a-DuIFNα-ELP;将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导表达制备DuIFNα-ELP;通过SDS-PAGE切胶方法得到纯化的DuIFNα-ELP;纯化产物免疫小鼠后收获血清,用Western blotting验证免疫血清的特异性,并用ELISA法检测其特异性抗体滴度。根据类弹性蛋白多肽（ELP）温度敏感的可逆相变特性,通过重复可逆相变循环（ITC）,在高盐离子浓度和临界温度下纯化重组蛋白,并采用微量细胞病变抑制法在MDCK/VSV系统中检测重组蛋白的抗病毒活性。结果表明:合成的重组鸭α-干扰素基因能成功表达,重组蛋白DuIFNα-ELP约80 ku,免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价为1∶1000000。抗病毒试验检测重组DuIFNα-ELP的抗病毒活性为1.0×106U/mL,比活性为1.25×106U/mg。这一结果为研制广谱、安全、高效的基因工程鸭α-干扰素提供参考,也为检测体内外DuIFNα的表达奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 主要试剂
•   1.2 菌株、载体、试验动物
•   1.3 基因序列的设计与合成
•   1.4 重组表达质粒的构建与测定
•   1.5 重组菌诱导表达与鉴定
•   1.6 重组蛋白制备与小鼠免疫
•   1.7 免疫血清效价测定
•   1.8 免疫血清的Western blotting鉴定
•   1.9 ITC纯化重组蛋白
•   1.1 0 包涵体变性与复性
•   1.1 1 纯化产物的抗病毒活性检测
• 2 结果与分析
•   2.1 DuIFNα基因的克隆结果和序列分析
•   2.2 鸭α-干扰素原核表达产物鉴定
•   2.3 胶回收产物鉴定
•   2.4 免疫血清抗体效价测定
•   2.5 免疫血清的Western blot鉴定分析
•   2.6 ITC纯化DuIFNα-ELP结果鉴定
•   2.7 重组蛋白的抗病毒活性检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 郭艳丽,朱善元,徐佳忆,吴植,王永娟

关键词: 干扰素,原核表达,抗体,纯化,抗病毒

来源: 中国家禽 2019年18期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 南京师范大学生命科学学院,江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室

基金: 江苏省高等学校自然科学研究重大项目（19KJA520008）,企事业单位横向合作课题（NSFPT201709,NSFPT201710）,江苏现代农业产业单项技术研发（CX(19)3005),2018年度自主创新重大项目(CX(18)1004)

分类号: S852.4

DOI: 10.16372/j.issn.1004-6364.2019.18.012

页码: 60-64

总页数: 5

文件大小: 1226K

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