甲型流感病毒重组抗体在家蚕杆状病毒表达系统中的表达与检测

论文摘要

甲型流感病毒对人类和禽类的威胁旷日持久,严重影响着人类健康和养殖业的发展。本研究所涉及的FI6抗体来源于人的浆细胞,是前人通过单细胞培养法从志愿者的外周血浆细胞中分离出一种单克隆抗体,能够识别并结合H1-H16所有血清型亚型的病毒。本研究将FI6的VL段和VH段通过短肽相连得到其Fv段,随后使用铰链（Hinge）与鸡IgY和人IgG的Fc段相连,得到两条抗体,分别为鸡源性抗体（FI6C）和人源性抗体（FI6H）。将氨基酸序列进行密码子优化后加入Kozak序列以期提高其翻译起始效率;添加终止密码子TAA以提高蛋白翻译终止效率;删除基因内部常用酶切位点,在两端加入BamH I、EcoR I和Xba I、PstI酶切位点以便进行基因克隆操作。利用酶切连接的方法将目的片段连接至pVL1393转移载体,随后通过转移载体与失活拯救型穿梭质粒共转染家蚕细胞将目的片段重组入杆状病毒中。随后感染五龄家蚕,收集蚕血淋巴,通过PCR鉴定,Western blot等方法鉴定其在家蚕中表达。随后进行体外实验来检测所设计的重组抗体的生物学活性,血凝抑制实验显示FI6H和FI6C具有一定的血凝抑制效果,两者均为1:160,与血凝素结合的能力相当。而在鸡成纤维细胞上进行的病毒中和实验显示FI6H对细胞的保护作用要比FI6C 好,FI6H 组 PD50 为 104+23/mL 蚕血淋巴;FI6C 组 PD50 为 10-2.79/mL蚕血淋巴。结果显示本研究成功利用家蚕-杆状病毒表达系统来表达所设计的两条重组单链甲型流感病毒中和抗体,对其进行的生物学活性检测表明其具有良好的生物学活性。为对抗甲型流感病毒的广谱抗体的规模化生产奠定了基础,同时也为广谱疫苗的研发提供了思路。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号注释表
• 1 文献综述
•   1.1 甲型流感病毒概述
•     1.1.1 甲型流感病毒
•     1.1.2 甲型流感病毒分子生物学
•     1.1.3 甲型流感病毒的预防和治疗
•   1.2 杆状病毒表达系统
•     1.2.1 昆虫杆状病毒
•     1.2.2 杆状病毒表达系统
•     1.2.3 杆状病毒表达载体的构建
•     1.2.4 本实验室构建的家蚕-杆状病毒表达系统
•     1.2.5 杆状病毒表达体系的优势
•   1.3 基于杆状病毒表达体系的应用
•     1.3.1 疫苗开发领域
•     1.3.2 农林畜牧等领域
•     1.3.3 杆状病毒作为基因呈递载体
• 2 引言
•   2.1 研究目的
•   2.2 研究意义
•   2.3 技术路线
• 3 材料与方法
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 主要实验材料和试剂
•     3.1.2 主要仪器
•     3.1.3 常用试剂的制备方法
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 目的基因的设计
•     3.2.2 重组转移载体的构建
•     3.2.3 重组杆状病毒的构建及目的蛋白在家蚕中的表达
•     3.2.4 FI6H和FI6C抗体的病毒中和实验
•     3.2.5 FI6H和FI6C的血凝抑制实验
• 4 实验结果与分析
•   4.1
•     4.1.1 重组抗体表达结果
•     4.1.2 FI6H和FI6C的序列分析及优化合成
•     4.1.3 FI6H和FI6C目的片段的获得
•     4.1.4 重组转移载体质粒pVL1393-FI6H和pVL1393-FI6C获得
•     4.1.5 重组杆状病毒的获得
•     4.1.6 重组杆状病毒感染家蚕
•     4.1.7 荧光素酶表达量检测
•     4.1.8 重组杆状病毒基因组PCR鉴定
•     4.1.9 家蚕表达的FI6H和FI6C的Western blot检测
•   4.2 FI6H和FI6C抗体的病毒中和实验结果
• 9N₂的TCID₅₀测定'>    4.2.1 H₉N₂的TCID₅₀测定
•     4.2.2 FI6H和FI6C抗体的病毒中和效价
•   4.3 FI6H和FI6C抗体血凝抑制实验
• 9N₂病毒的血凝素凝集价（HAU）'>    4.3.1 H₉N₂病毒的血凝素凝集价（HAU）
•     4.3.2 FI6H和FI6C抗体血凝抑制效价
• 5 讨论
• 6 全文结论
• 7 参考文献
• 附录
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王先翔

导师: 叶爱华,张志芳

关键词: 甲型流感病毒,中和抗体,单链抗体,家蚕杆状病毒表达系统,血凝抑制

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 安徽农业大学

基金: 国家重点研发计划课题:鸡重要疫病免疫防控新技术研究(2017YFD0500706),国家自然基金:家蚕多角体病毒呈递外源基因到脊椎动物组织的机理研究(31670156)

分类号: S852.65

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000326

总页数: 67

文件大小: 4196K

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