EV71病毒反向遗传学系统的建立及拯救病毒的鉴定

论文摘要

目的:建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,快速获得拯救病毒并鉴定其活性。方法:首先构建含有人RNA聚合酶Ⅰ启动子（PpolⅠ）、ccdB自杀基因和鼠终止子（mTer）的接收质粒pHM-ccdB,并在ccdB两侧引入AarⅠ酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarⅠ酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarⅠ酶切位点,通过Golden Gate Clone技术连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。结果:通过引入ccdB致死基因和Golden Gate Clone成功构建了EV71病毒的拯救质粒（pHT-EV71）,并将其转染至RD细胞后,观察到明显的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,将得到的拯救子代病毒,经EV71 VP1的特异性引物进行RT-PCR扩增,观察到长约1 900 bp的特异性条带;Western blot结果显示,该病毒可与EV71 VP1特异抗体结合;透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）检测可见20～30 nm球形病毒颗粒;在RD细胞中将子代病毒连续增殖8代后,检测其毒力高于母本株（6.35 lgTCID50/mL）。结论:通过引入ccdB和Golden Gate Clone技术,建立了快速、高效构建EV71病毒的拯救质粒的方法,效率达到100%,为正链RNA病毒反向遗传学系统的构建提供了一种新的策略,为进一步研究EV71病毒的致病机制及疫苗制备等提供了技术平台。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1主要试剂与质粒
•   1.2 菌种、细胞与EV71病毒
•   1.3 引物与载体构建
•   1.4 从质粒中拯救EV71病毒
•   1.5 拯救病毒的鉴定
• 2 结果
•   2.1 EV71病毒拯救质粒的构建
•   2.2 病毒的拯救及鉴定
•   2.3 病毒的毒力鉴定及比较
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 庄稀尧,卢楠,唐弘,李智颖,陈俊伊,熊雨涵,徐蕾,王瑜伟,康月茜,杨春

关键词: 肠道病毒,病毒拯救,病毒滴度

来源: 重庆医科大学学报 2019年11期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,基础医学

单位: 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心病原生物学实验室,重庆市中医院检验科,绵阳市第三人民医院·四川省精神卫生中心

基金: 重庆市自然科学基金资助项目（编号：cstc2016jcyjA0212）,重庆市科委基础科学与前沿技术（一般）资助项目（编号：cstc2016jcyjA0277）,四川省卫计委资助项目（编号：18PJ016）

分类号: R373

DOI: 10.13406/j.cnki.cyxb.001917

页码: 1479-1484

总页数: 6

文件大小: 369K

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