N6-methyladenosine调控肠病毒71型的复制

论文摘要

N6-methyladenosine（m6A）是第一个被发现的可逆的RNA修饰,也是分布最广泛的RNA修饰,在RNA的代谢及功能中发挥重要作用。早在40年前已发现病毒RNA含有m6A修饰,但由于技术和知识的限制,病毒m6A的功能并不清楚。直到最近才有报道称m6A修饰存在于艾滋病病毒、流感病毒、黄病毒等病毒的RNA并调控病毒的感染与复制。目前关于病毒m6A修饰及其功能的研究较少且分子机制不清楚,病毒m6A的研究在未来一段时间仍将是病毒表观遗传学研究的热点和难点。为研究EV71 RNA m6A修饰的功能,我们首先使用UHPLC、MeRIP-Northern Blot和MeRIP-Seq等方法证明EV71基因组RNA的VP、2C和3D等蛋白编码区含有m6A修饰。使用Western Blot检测,我们发现EV71感染导致宿主m6A修饰甲基化酶和结合蛋白表达增加而去甲基化酶表达降低,免疫荧光结果显示这些蛋白的细胞定位发生了改变。为验证m6A修饰对病毒复制的影响,我们敲低了甲基化酶和去甲基化酶,发现病毒的复制分别被抑制和增强;另外,敲低m6A结合蛋白,EV71的复制也受到明显影响。为进一步验证m6A的功能,我们突变了EV71 RNA的m6A位点,发现病毒复制被明显抑制。这些结果说明m6A修饰影响病毒复制。最后,我们探索了m6A修饰系统影响病毒复制的分子机制。质谱结果显示甲基化酶METTL3和EV71的3D蛋白存在相互作用,Western Blot和免疫荧光结果进一步证实了这一相互作用。通过改变METTL3的表达,我们发现3D蛋白的稳定性被影响。由于有报道称SUMO化和泛素化影响3D蛋白的稳定性和RNA聚合酶活性,因此METTL3可能通过这一途径影响病毒的复制。SUMO化和泛素化检测发现:METTL3促进3D的SUMO化和泛素化修饰,说明METTL3可通过影响3D蛋白的转录后修饰影响病毒复制。综上所述,我们发现EV71 RNA含有m6A修饰且m6A修饰系统在病毒感染过程中发挥重要功能。我们的研究有助于进一步了解病毒m6A修饰的功能,对今后病毒表观遗传学的研究具有借鉴意义,同时为病毒的防治提供了新的思路和可能的药物靶标。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 引言
• 6-methyladenosine（m⁶A）修饰'>  1.1 N⁶-methyladenosine（m⁶A）修饰
•     1.1.1 RNA的修饰
• 6A修饰'>    1.1.2 可逆的m⁶A修饰
• 6A修饰的功能'>    1.1.3 m⁶A修饰的功能
• 6A修饰的研究'>  1.2 病毒m⁶A修饰的研究
• 6A在 RNA病毒感染中的影响'>    1.2.1 m⁶A在 RNA病毒感染中的影响
• 6A在 DNA病毒感染中的影响'>    1.2.2 m⁶A在 DNA病毒感染中的影响
•   1.3 肠病毒71型（enterovirus71,EV71）
•     1.3.1 肠病毒
•     1.3.2 EV71
•   1.4 本研究的主要内容和意义
• 第2章 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 细胞
•     2.1.2 菌株
•     2.1.3 病毒
•     2.1.4 质粒
•   2.2 主要试剂、仪器
•   2.3 主要培养基的配置
•   2.4 主要试剂的配置
•   2.5 实验方法
• 第3章 实验结果
• 6A修饰'>  3.1 EV71RNA基因组含有m⁶A修饰
• 6A甲基化酶、去甲基化酶和结合蛋白的表达及细胞定位'>  3.2 EV71感染影响m⁶A甲基化酶、去甲基化酶和结合蛋白的表达及细胞定位
• 6A甲基化酶、去甲基化酶和结合蛋白的表达'>    3.2.1 EV71感染影响m⁶A甲基化酶、去甲基化酶和结合蛋白的表达
• 6A甲基化酶、去甲基化酶和结合蛋白的细胞定位'>    3.2.2 EV71感染影响m⁶A甲基化酶、去甲基化酶和结合蛋白的细胞定位
• 6A甲基化酶和去甲基化酶调控EV71m⁶A修饰和病毒复制'>  3.3 m⁶A甲基化酶和去甲基化酶调控EV71m⁶A修饰和病毒复制
• 6A修饰的甲基化酶和去甲基化酶'>    3.3.1 METTL3和FTO是 EV71m⁶A修饰的甲基化酶和去甲基化酶
• 6A甲基化酶和去甲基化酶调控EV71复制'>    3.3.2 m⁶A甲基化酶和去甲基化酶调控EV71复制
• 6A结合蛋白影响EV71复制'>  3.4 m⁶A结合蛋白影响EV71复制
• 6A修饰位点突变影响病毒复制'>  3.5 EV71RNA m⁶A修饰位点突变影响病毒复制
• 6A修饰位点'>    3.5.1 EV71RNA上A3055和A4555是m⁶A修饰位点
• 6A修饰位点抑制EV71复制'>    3.5.2 突变m⁶A修饰位点抑制EV71复制
•   3.6 METTL3和EV713D蛋白相互作用且影响3D SUMO和泛素化修饰
•     3.6.1 METTL3与3D存在相互作用
• 6A甲基化复合体主要蛋白存在相互作用'>    3.6.2 3D与m⁶A甲基化复合体主要蛋白存在相互作用
•     3.6.3 3D与METTL3的相互作用不依赖METTL3的催化活性
• 6A修饰不依赖3D与甲基化酶的相互作用'>    3.6.4 EV71RNA的m⁶A修饰不依赖3D与甲基化酶的相互作用
•     3.6.5 METTL3促进3D蛋白SUMO化和泛素化修饰
• 第4章 讨论
• 第5章 总结与展望
•   5.1 总结
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 郝好杰

导师: 关武祥

关键词: 肠病毒型,病毒复制

来源: 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)

分类号: R373.2

总页数: 121

文件大小: 7837K

下载量: 218