氧化石墨烯装载金丝桃素抗新型鸭呼肠孤病毒作用研究

论文摘要

新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）较经典的鸭呼肠孤病毒（Duck reovirus,DRV）宿主谱范围更广,目前没有用于预防和治疗该病毒病的生物制品,因此给疾病预防和控制带来了很大的困难。金丝桃素（Hypericin,HY）是贯叶金丝桃中提取的一种中药单体,具有广谱的抗病毒活性,包括各种逆转录病毒,但因其水溶性较差和细胞毒性等特点限制了它的应用。随着纳米技术的发展壮大,氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）被不断的运用到生物医学领域。GO因其独特的结构而具有较高载药能力,并已成为生物医学应用中最具有前景的生物材料。本研究通过GO装载HY,降低了HY对DF-1细胞的细胞毒性,对其复合物进行表征及装载效率的测评,并研究该复合物对新型鸭呼肠孤病毒NDRV-TH11株体内及体外的抗病毒作用效果,为抗鸭呼肠孤病毒药物的开发奠定基础。本研究分为以下几个部分:1氧化石墨烯对金丝桃素的装载、表征及细胞毒性研究采用共混法制备氧化石墨烯/金丝桃素复合物（GO/HY）,计算其装载效率为72.5%;用原子力显微镜（AFM）观察其片层形貌,通过片层厚度分析可知,金丝桃素有效的负载在氧化石墨烯上。通过MTT法检测其细胞毒性,结果如下:当GO浓度达到100?g/mL时,其细胞存活率高达93.16%;与单独的HY相比,经GO负载的HY对DF-1细胞的毒性更低,当HY浓度达到72.5?g/mL时,细胞存活率为91.3%,而GO/HY作用下DF-1细胞存活率高达93.83%。2氧化石墨烯/金丝桃素复合物（GO/HY）体外抗NDRV活性研究以新型鸭呼肠孤病毒TH11株为研究对象,用CPE、滴度法检测GO/HY体外抗NDRV活性。结果如下:通过CPE法观察GO/HY对DNRV引起的DF-1细胞损伤的抑制作用。结果发现,当GO/HY浓度为72.5?g/mL时,细胞病变完全被抑制。用不同浓度的GO/HY处理NDRV感染的DF-1细胞,发现与病毒对照组相比,GO/HY处理组病毒TCID50随着GO/HY浓度的增加而降低。由以上结果可知,GO/HY具有良好的体外抗NDRV活性。3 GO/HY对NDRV体外复制的影响通过测定病毒生长曲线、噬斑减少试验、蛋白质免疫印迹（WB）和间接免疫荧光（IFA）等方法观察GO/HY对体外NDRV复制的影响。结果如下:测定病毒组与GO/HY治疗组（72.5?g/mL）病毒的生长曲线,结果发现病毒对照组接毒48 h后其病毒滴度可达到107.8,治疗组接毒48 h病毒滴度只能达到104.2,说明金丝桃素能明显抑制NDRV在DF-1中的扩增。噬斑试验结果发现各剂量GO/HY治疗组空斑数目明显少于病毒对照组,阴性对照无空斑出现,说明GO/HY可显著抑制DNRV的毒力。通过Western blot检测?C蛋白蛋白表达情况,结果发现当GO/HY浓度为18.125?g/mL时,与病毒对照组一样在35kDa处出现特异性条带,但条带大小明显减弱,中浓度和高浓度GO/HY治疗组无目的条带出现。IFA结果分析显示,病毒组可见明显的绿色荧光,而GO/HY治疗组（72.5?g/mL）的绿色荧光强度则明显减弱。由以上结果可知,GO/HY可显著抑制DNRV的体外复制能力,且抑制效果呈现明显的剂量依赖性。4 GO/HY对NDRV作用特征的研究采取不同用药方式,通过（基于SYBR Green）荧光定量PCR方法对比GO/HY对NDRV感染细胞不同作用阶段的抗病毒效果。结果如下:通过三种方式考察GO/HY体外抗NDRV活性,利用已建立的SYBR Green II荧光定量PCR方法,计算三种模式下,?C基因的相对表达量,结果发现:与提前加药组相比,感染后加药与同时加药组中,?C基因相对表达量明显降低,由此可见,GO/HY在NDRV感染DF-1过程中主要起作用的阶段为病毒侵入细胞的吸附阶段。5 GO/HY体内抗NDRV活性通过肌肉注射建立NDRV-TH11强毒株樱桃谷鸭雏鸭模型。接毒1-7 d后,分别用不同剂量GO/HY给鸭口服灌喂给药,并在停药后继续观察7天,结果如下:各剂量组GO/HY均能延长染毒鸭的存活时间。病毒感染组第3天开始出现死亡情况,5天后全部死亡,存活率为0,而药物治疗组存活时间延长,高剂量组存活率可达40%,说明GO/HY提高了染毒鸭的存活率。通过已建立的SYBR Green II实时PCR方法检测每个处理组中,鸭的肝脏和肺脏组织的病毒载量,结果发现,治疗剂量越高,其?C基因的转录水平越低,说明GO/HY对组织中的病毒载量具有明显的抑制效果。组织病理切片观察到GO/HY能够明显改善染毒鸭肝脏、肺脏组织的病变情况;且由免疫组化结果可知病毒在肝脏、肺脏组织中的分布随药物治疗剂量的增加而减少。本试验利用氧化石墨烯装载金丝桃素,同时探究该复合物GO/HY体内外抗NDRV效果,发现GO/HY可通过早期抑制NDRV靶基因的转录及靶蛋白的表达来抑制NDRV的复制。同时GO/HY可通过抑制NDRV在染毒鸭体内的复制来延缓其死亡时间,减轻染毒鸭靶器官的损伤。GO/HY对新型鸭呼肠孤病毒NDRV-TH11株体内及体外的抗病毒作用效果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明一览表
• 第一部分 文献综述及立题依据
•   第一章 文献综述
•     1 新型鸭呼肠孤病毒
•       1.1 病原学
•       1.2 流行病学
•       1.3 临床症状与病理变化
•       1.4 防治措施
•     2 金丝桃素药理研究进展
•       2.1 抗病毒作用
•       2.2 抗抑郁作用
•       2.3 抗癌抗肿瘤作用
•       2.4 抗菌作用
•     3 氧化石墨烯生物医学领域研究进展
•       3.1 结构及合成工艺
•       3.2 氧化石墨烯作为药物、基因递送载体材料的研究
•       3.3 药物控释
•       3.4 作为免疫增强剂
•       3.5 光动力治疗及生物成像
•       3.6 作为抗菌材料的研究
•       3.7 生物安全性
•   第二章 立题依据和目的意义
•     1 立题依据
•     2 目的意义
•     3 研究内容
• 第二部分 实验研究
•   第一章 氧化石墨烯/金丝桃素的制备、表征及细胞毒性研究
•     1 实验材料
•       1.1 仪器
•       1.2 试药
•     2 试验方法
•       2.1 金丝桃素标准曲线的建立
•       2.2载药实验
•       2.3 GO、GO/HY的表征
•       2.4 细胞培养及毒性检测
•     3 结果
•       3.1 标准曲线及GO载药量
•       3.2 GO、GO/HY形貌
•       3.3 细胞毒性
•     4 讨论
•     5 小结
•   第二章 GO/HY体外抗鸭呼肠孤病毒（NDRV）作用
•     1 材料
•       1.1 主要仪器设备
•       1.2 试药
•       1.3 试剂及培养基
•       1.4 细胞及毒株
•     2 试验方法
•       2.1 NDRV病毒扩增
•       2.2 GO/HY对 NDRV致 DF-1 细胞病变效应的影响
•       2.3 GO/HY对 NDRV滴度的影响
•       2.4 噬斑实验观察GO/HY对 NDRV病毒滴度的影响
•       2.5 GO/HY对 NDRV在 DF-1 细胞中生长曲线的影响
•       2.6 GO/HY对 NDRV不同作用阶段的抗病毒硏究
•       2.7 WESTERN BLOT、IFA检测NDRV?C蛋白的表达
•     3 结果
•       3.1 细胞形态学观察
•       3.2 GO/HY对 NDRV滴度的影响
•       3.3 噬斑实验观察GO/HY对 NDRV病毒滴度的影响
•       3.4 GO/HY对 NDRV生长曲线的影响
•       3.5 GO/HY对 NDRV不同作用阶段的研究
•       3.5 GO/HY对 NDRV?C蛋白表达的影响
•     4 讨论
•     5 小结
•   第三章 GO/HY体内抗NDRV活性
•     1 材料
•       1.1 主要设备仪器
•       1.2 试验动物与毒株
•       1.3 试药
•     2 方法
•       2.1 动物分组及给药
•       2.2 组织中NDRV的 SYBR-GREEN荧光定量检测
•       2.3 病理组织切片观察（HE）
•       2.4 免疫组织化学检测（IHC）
•     3 结果
•       3.1 GO/HY对 NDRV感染鸭死亡率的影响
•       3.2 GO/HY对 NDRV感染鸭组织病毒载量的影响
•       3.2 组织病理学观察
•       3.2 免疫组化结果观察
•     4 讨论
•     5 小结
• 第三部分 结论与创新
•   1 主要结论
•   2 创新点
•   3 需要进一步解决的问题
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杜夏夏

导师: 舒刚

关键词: 氧化石墨烯,金丝桃素,新型鸭呼肠孤病毒,抗病毒活性

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000986

总页数: 67

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