高温液体脂肪酶的设计

论文摘要

液体脂肪酶,是一种没有任何溶剂、水含量极低（0.3–0.6 wt%）、同时又均匀分散的液体纳米杂合生物催化剂（无溶剂液体酶）。它具有很高的热稳定性,能在极端高温下（150oC）直接溶解并转化底物,为工业催化提供了一个全新的选择。目前,液体脂肪酶的研究还处于探索阶段,作为蛋白质表面电荷化学修饰的产物,还存在活力严重下降等问题。在本研究中,我们以Bacillus subtilis脂肪酶A（BsLA）为研究模型,采用定点突变和化学修饰相结合的策略,探究了酶分子表面电荷的数量和分布分别对天然（未经化学修饰的）脂肪酶和液体脂肪酶的制备、结构、活力和稳定性的影响,并在提高天然脂肪酶活力和稳定性的同时也提高了液体脂肪酶的活力和生物物理性质,并且液体BsLA脂肪酶在100 oC仍有一定的水解活力。此外,我们还设计了一种全新的修饰策略,大幅度提高了液体脂肪酶的活力。液体脂肪酶是通过对脂肪酶和聚合物的交联体溶液的彻底冷冻干燥和加热退火制备而来,它包含一个球形蛋白质“核”以及包被在蛋白质表面的聚合物分子“壳”。正是这一层“壳”扩大了蛋白质分子间发生引力作用的间距范围,并保证了没有溶剂的蛋白质在常温常压下的液体状态。在液体脂肪酶的合成中,脂肪酶表面与聚合物之间的静电引力作用至关重要,通过化学修饰使蛋白质表面充满一致的正电荷（阳离子修饰）,从而能静电结合一定数量的阴离子聚合物表面活性剂（anionic polymer surfactant,简称S聚合物）,最终形成阳离子型液体酶。蛋白质的电荷由结构中的羧基和氨基在特定的pH条件下电离产生。自然界中,绝大多数的蛋白质在维持其结构和功能中都离不开电荷的作用,如蛋白质的折叠与稳定、酶与底物的结合与催化、蛋白质的溶解与沉淀等等。同时,酶分子表面电荷修饰在酶工程领域已被证明是一种重要的工具,通过化学修饰或定点突变可以提高酶的稳定性、活力和溶解性。在这些研究中,阴离子修饰和引入酸性残基的定点突变往往能提高酶的活力和稳定性。BsLA就是以上表面电荷修饰研究中的一个典型模型酶,通过定点突变向BsLA表面引入羧基可以提高酶的活力和稳定性。因此,为了探究BsLA表面电荷的数量和分布对阳离子型液体脂肪酶性质的影响,我们合理设计了BsLA表面电荷不同的数量和分布。在已报道的离子液体耐受性和热稳定性分别得到提高的两组BsLA突变酶中,我们各选择了4个在活性中心附近区域引入酸性残基的突变位点,设计并构建了2个四重突变体（4M1和4M2）,然后将8个点突变合并,构建了一个八重突变体（8M）。通过对BsLA野生型和3个突变体活力和稳定性的研究,我们发现,8M在离子液体[BMIM][Cl]中的半衰期在4M1（474 min）的基础上提高到了965 min;同时,8M具有极强的热稳定性,其T50在4M2（63.2oC）的基础上提高到了97oC。以上结果表明,两组不同的点突变在提高酶的热稳定性和离子液体耐受性方面具有明显效果并且表现出一定的累加效应。通过定点突变来改变BsLA表面羧基的分布,我们实现了在阳离子型液体脂肪酶合成中蛋白质表面电荷的差异化修饰。我们测定了WT、4M1、4M2和8M液体脂肪酶的酯酶活力,同时借助同步辐射圆二色谱（SRCD）、小角X射线散射（SAXS）等技术手段对蛋白质结构进行了表征。结果表明,蛋白质表面S聚合物结合位点的数量和分布对液体脂肪酶的物理性状、结构和活力都有重要影响,同时S聚合物在维持脂肪酶结构和活力方面具有关键作用。和WT相比,4M2作为天然状态下活力和稳定性更高的BsLA突变体,以其为前体制备的液体脂肪酶的生物物理性质和活力也都得到了提高。因此,通过定点突变改变酶分子表面电荷数量和分数能影响最终无溶剂液体酶制备的成败。有报道认为表面阴离子修饰更有利于提高酶的活力和稳定性,因此,我们设计了全新的阴离子修饰方法修饰BsLA八重突变体（8M）,再与阳离子聚合物表面活性剂（cationic polymer surfactant,简称cS聚合物）进行交联合成阴离子型无溶剂液体酶。研究结果表明,阴离子型8M液体酶的结构与天然8M接近,并且其活力是阳离子型8M液体酶的3.5倍。此外,我们以表面Lys残基含量较多的肌红蛋白（myoglobin,Mb）为模型,分析了阴离子修饰方法制备液体蛋白的适用性。尽管阴离子修饰引起了Mb的完全变性,但是其结构在合成的阴离子型液体Mb中得到了一定的恢复,其中α-螺旋组成比例还高于阳离子型液体Mb。在这一研究中,我们通过阴离子修饰成功获得了具有高活力的液体脂肪酶,同时,我们还阐述了以上两种不同类型的修饰手段对合成液体蛋白的影响,为进一步的研究打下基础。本研究表明,蛋白质表面电荷修饰本身是提高酶活力和稳定性的重要工具,在无溶剂液体酶的研究中更具关键作用。本研究结合了脂肪酶的定点突变和化学修饰,既提高了天然脂肪酶在水溶液中的活力和稳定性,也提高了对应的液体脂肪酶的活力和生物物理性质;设计了全新的阴离子修饰方法,制备了性能更优异的阴离子型液体酶,为无溶剂液体酶的进一步发展和应用提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩略词
• 第1章 绪论
•   1.1 无溶剂液体酶的研究
•     1.1.1 无溶剂液体酶的理论基础
•     1.1.2 无溶剂液体蛋白的合成
•     1.1.3 无溶剂液体肌红蛋白的结构与功能
•     1.1.4 无溶剂液体脂肪酶的结构与活力
•     1.1.5 表面电荷修饰对液体酶活力的影响
•   1.2 酶的表面电荷修饰
•     1.2.1 酶的表面电荷与净电荷
•     1.2.2 酶表面电荷化学修饰的分类及应用
•     1.2.3 定点突变改变酶表面电荷数量和分布
•   1.3 本研究所用的模型酶
•   1.4 液体酶的结构表征技术
•     1.4.1 同步辐射圆二色谱
•     1.4.2 小角X射线散射
•     1.4.3 傅里叶变换衰减全反射红外光谱
•   1.5 本文研究目的及设计思路
• 第2章 BsLA表面电荷分布的合理设计
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 实验仪器
•     2.2.2 实验材料与试剂
•     2.2.3 实验方法
•   2.3 实验结果与讨论
•     2.3.1 定点突变增加BsLA表面电荷
•     2.3.2 突变对BsLA结构和活力的影响
•     2.3.3 突变对BsLA热稳定性的影响
•     2.3.4 突变对BsLA离子液体耐受性的影响
•   2.4 本章小结
• 第3章 阳离子型BsLA液体酶的合成与表征
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 实验仪器
•     3.2.2 实验材料与试剂
•     3.2.3 溶液配制
•     3.2.4 实验方法
•   3.3 实验结果与讨论
•     3.3.1 BsLA及其突变体液体酶的合成
•     3.3.2 BsLA及其突变体液体酶的结构
•     3.3.3 液体脂肪酶的活力对比
•     3.3.4 液体脂肪酶的热稳定性
•   3.4 本章小结
• 第4章 阴离子型BsLA液体酶的合成与表征
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 实验仪器
•     4.2.2 实验材料与试剂
•     4.2.3 溶液配制
•     4.2.4 实验方法
•   4.3 实验结果与讨论
•     4.3.1 阳离子聚合物表面活性剂的合成
•     4.3.2 阴离子型液体酶的合成
•     4.3.3 阴离子型液体脂肪酶的结构
•     4.3.4 阴离子型液体Mb的结构
•     4.3.5 阴离子型液体脂肪酶的活力
•     4.3.6 阴离子型液体脂肪酶的热稳定性
•     4.3.7 阴离子型液体Mb热稳定性
•   4.4 本章小结
• 第5章 结论与展望
• 参考文献
• 作者简介及科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 周烨

导师: 高仁钧

关键词: 液体酶,脂肪酶,表面电荷修饰,定点突变,无溶剂液体蛋白,聚合物表面活性剂

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 吉林大学

分类号: Q814

总页数: 130

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